Avances en el Análisis de Proteínas Usando BONCAT

El análisis de espectrometría de masas (MS) ayuda a los científicos a estudiar proteínas en muestras biológicas complejas. Este enfoque ha permitido a los investigadores descubrir cambios importantes en los niveles de proteínas debido a diversas actividades biológicas. Sin embargo, cuando se estudian proteínas en tejidos o células, identificar cambios pequeños puede ser complicado. Un método para abordar este problema se llama etiquetado de aminoácidos no canónicos biortogonales (BONCAT), que ofrece una forma de etiquetar proteínas producidas durante un período específico.

#¿Qué es BONCAT?

BONCAT utiliza aminoácidos especiales que no se encuentran de forma natural en las proteínas. Estos aminoácidos se usan para etiquetar nuevas proteínas hechas durante un período particular. La idea es que las proteínas recién hechas reaccionarán de manera diferente a los cambios biológicos en comparación con las proteínas más viejas. Al enfocarse en estas nuevas proteínas, los investigadores pueden evitar la confusión que viene de mezclar proteínas viejas y nuevas, facilitando ver cambios que podrían haberse pasado por alto.

El aminoácido no canónico más utilizado para este método es el Azidohomoalanina (AHA). Cuando los investigadores añaden AHA a las células, se incorpora en proteínas nuevas en lugar del aminoácido regular metionina, que está presente de forma natural en muchas proteínas. Esto sucede porque la metionina compite con AHA por su incorporación en las proteínas. Dado que la metionina es esencial para la supervivencia celular, los investigadores no pueden eliminarla completamente durante los experimentos, pero pueden reducir sus niveles para que AHA se use de manera más efectiva.

#Uso de AHA en Varios Organismos

Originalmente, AHA se usaba principalmente en células en cultivo, pero desde entonces se ha aplicado en estudios que involucran organismos más complejos, como el nematodo C.elegans y ratones. La investigación muestra que las proteínas etiquetadas con AHA se comportan de manera similar a sus contrapartes naturales. Esto significa que tienen la misma estructura, estabilidad y función. Estudios encontraron que estas proteínas AHA responden a cambios biológicos igual que las proteínas no modificadas.

Otro aminoácido no canónico que ofrece selectividad es el Azidonorleucina (ANL). ANL necesita una versión modificada de la metionina tRNA sintasa para incorporarse correctamente en las proteínas. Este método permite a los científicos dirigirse a células específicas al estudiar proteínas, proporcionando más perspectivas enfocadas.

#El Protocolo DidBIT

Para mejorar cómo se analizan las proteínas usando AHA, nuestra investigación utilizó una estrategia llamada DidBIT (Detección Directa de Etiquetas que Contienen Biotina). En DidBIT, los péptidos etiquetados con AHA se enriquecen usando perlas especiales que se unen firmemente a la biotina. Después de unir los péptidos a estas perlas, los investigadores pueden lavar cualquier otra cosa y enfocarse solo en los péptidos etiquetados. Este paso es crucial para aumentar la sensibilidad del análisis, permitiéndonos detectar cantidades menores de proteínas.

En nuestros experimentos, comparamos cuán bien funcionaron dos tipos de etiquetas de biotina: una que se puede separar y otra que no. Al usar diferentes cantidades de tejido cerebral etiquetado con AHA, pudimos ver qué método funcionaba mejor.

#Métodos

Cultivamos dos tipos de células a una temperatura controlada y niveles de CO2. Después de preparar estas células, las transfectamos con un gen modificado para introducir el mMetRS. Esto introdujo el método modificado para incorporar los aminoácidos especiales.

Después de tratar las células con AHA o ANL, realizamos una serie de pasos para extraer y analizar las proteínas. Esto involucró usar un sonicator para romper las células y mezclar las proteínas con tampones de muestra. Luego, usamos electroforesis para separar las proteínas según su tamaño y las transferimos a membranas especiales para un análisis adicional.

Después de esto, etiquetamos las proteínas y las cuantificamos usando un método llamado clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Este método nos permitió aislar células que habían tomado con éxito los genes modificados.

Para los experimentos con animales, alojamos ratones en ambientes controlados. Los animales fueron alimentados con dietas que contenían AHA o ANL. Después del tratamiento, recolectamos los cerebros para analizar cuán bien se habían incorporado estos aminoácidos no canónicos en las proteínas.

#Resultados: Comparando AHA y ANL

En nuestro análisis, encontramos que la incorporación de AHA se eliminó casi por completo en presencia de metionina, mientras que ANL mostró solo una ligera reducción. Esto indicó que la incorporación de ANL era más eficiente que la de AHA cuando había metionina presente. Sin embargo, en general, AHA se incorporó a las proteínas con más éxito que ANL.

Nuestras pruebas mostraron que la etiqueta de biotina que se puede separar (DADPS) fue más efectiva para detectar péptidos etiquetados con AHA en comparación con la etiqueta de biotina que no se puede separar (UnC). Cuando analizamos diferentes cantidades de tejido cerebral, DADPS consistentemente identificó más péptidos que UnC, subrayando su sensibilidad.

#El Papel de la Etiquetación TMT

También investigamos si TMT, una técnica de etiquetado utilizada para cuantificar proteínas, afectaría nuestros resultados con los péptidos etiquetados con AHA. Cuando probamos esto con ambas etiquetas de biotina, encontramos que DADPS aún superaba a UnC, identificando más péptidos AHA incluso cuando se aplicó TMT. Esto sugiere que DADPS es compatible con técnicas de cuantificación de proteínas mientras mantiene su efectividad.

#Diferencias Entre Péptidos DADPS y UnC

Al examinar los datos de nuestros experimentos, notamos diferencias significativas entre los dos tipos de péptidos. Los péptidos DADPS se eluyeron más eficientemente de las perlas en comparación con los péptidos UnC, lo que podría ser una razón para el mejor rendimiento de DADPS.

Además, encontramos que los péptidos DADPS mostraron una distribución más amplia en el perfil cromatográfico, lo que significa que se separaron mejor durante el análisis. En contraste, los péptidos UnC aparecieron más tarde, indicando que podrían haber sido menos estables o fragmentados de manera deficiente durante el análisis de MS.

Esta diferencia de fragmentación fue evidente en nuestro sistema de puntuación para la identificación de péptidos. Los péptidos DADPS recibieron puntuaciones más altas, lo que significa que fueron detectados de manera más confiable que los péptidos UnC más grandes, que tuvieron dificultades debido a su tamaño.

#Resumen y Conclusión

En resumen, el enfoque BONCAT utilizando DADPS para etiquetar proteínas ofrece una mejor sensibilidad para detectar proteínas recién sintetizadas en comparación con los métodos tradicionales. La eficiencia de AHA en la incorporación de proteínas, incluso en presencia de metionina, resalta su utilidad en el estudio de la dinámica de proteínas en las células.

Al refinar nuestros métodos y comparar diferentes etiquetas de biotina, podemos mejorar nuestra comprensión de la función de las proteínas en sistemas biológicos complejos. Este trabajo allana el camino para estudios más detallados de proteínas en varios organismos y condiciones, lo que potencialmente lleva a nuevos conocimientos en investigación biológica y medicina.