Métodos mejorados para detectar parásitos de la malaria
Nuevas pruebas mejoran la detección de parásitos de la malaria en el sudeste asiático.
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Tabla de contenidos
Plasmodium knowlesi es un parásito chiquito que causa malaria y se encuentra en el sudeste asiático. Normalmente vive en monos y se propaga por mosquitos. En Malasia, es la causa más común de malaria en personas y puede llevar a enfermedades graves, similar a otro tipo de malaria causada por Plasmodium falciparum. Además de P. knowlesi, también se ha detectado otro parásito relacionado, P. cynomolgi, en infecciones humanas.
Detectar con precisión estos parásitos es clave para entender cómo se propagan y mejorar las medidas para controlar la malaria. Esto es especialmente importante en áreas donde coexisten especies de malaria zoonótica (relacionada con animales) y no zoonótica (relacionada con humanos). Mejorar los métodos de Detección es crucial para los programas nacionales que buscan eliminar la malaria.
Desafíos de Detección
Los métodos tradicionales usados para diagnosticar malaria, como la microscopía, a menudo fallan al detectar infecciones de bajo nivel. No pueden diferenciar de manera confiable entre los diferentes tipos de parásitos de malaria cuando se ven similares bajo un microscopio. Por ejemplo, P. knowlesi puede parecerse a P. malariae, y P. cynomolgi se puede confundir fácilmente con P. vivax. Las pruebas rápidas que identifican proteínas del parásito en la sangre también no logran detectar P. knowlesi en niveles bajos.
En los últimos años, se han creado varios métodos moleculares para encontrar P. knowlesi. Estos implican el uso de una técnica llamada PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para identificar el Material Genético del parásito. Sin embargo, no ha habido una comparación exhaustiva de cómo funcionan estos métodos, especialmente al detectar cantidades bajas del parásito.
Recolección y Pruebas de Muestras
Para mejorar los métodos de detección, los investigadores recogieron muestras de sangre de pacientes con malaria y controles sanos en Malasia e Indonesia. Se tomó sangre antes de cualquier tratamiento para asegurar resultados precisos. Estas muestras se congelaron para pruebas posteriores. Además, se crearon manchas de sangre seca (DBS) usando pequeñas cantidades de sangre y se almacenaron adecuadamente para preservarlas para un análisis futuro.
La examinación microscópica de las muestras involucró a técnicos capacitados que contaron la cantidad de parásitos presentes. Esto ayudó a cuantificar el nivel de infección de malaria en cada paciente.
Extracción de Material Genético
El siguiente paso implicó extraer el material genético total de las muestras de sangre recogidas. Esto se hizo utilizando un kit especial diseñado para la extracción de ADN. Para las manchas de sangre seca, se utilizó un método diferente para asegurar que se obtuviera correctamente el material genético.
Después de la extracción, los investigadores utilizaron PCR para amplificar e identificar la presencia de marcadores genéticos específicos de malaria. Estas pruebas se realizaron en un laboratorio controlado para asegurar la precisión. Los investigadores siguieron realizando pruebas para confirmar qué tipo de parásito de malaria estaba presente en cada muestra.
Evaluación de Límites de Detección
Los investigadores querían entender qué tan bien podían detectar los parásitos en niveles muy bajos. Para hacerlo, diluyeron muestras que contenían cantidades conocidas de parásitos y probaron estas muestras diluidas usando tanto métodos estándar de PCR como aquellos que incluían un paso adicional de transcripción inversa.
Este paso extra se incluyó para mejorar la sensibilidad, ya que puede ayudar a detectar infecciones de bajo nivel. Los investigadores calcularon cuán baja podía ser la cantidad de parásitos mientras siguiera siendo detectada de manera confiable.
Resultados de la Evaluación
Los hallazgos mostraron que agregar el paso de transcripción inversa mejoró significativamente la capacidad de detectar P. knowlesi y redujo los límites de detección a niveles mucho más bajos que los logrados con métodos estándar. Esta mejora indica que usar transcripción inversa podría ayudar a encontrar parásitos en etapas tempranas de infección, cuando es menos probable que sean detectados por métodos tradicionales.
La sensibilidad de las pruebas varió entre diferentes tipos de malaria. Las pruebas para P. knowlesi funcionaron particularmente bien, mostrando que este método podría detectar de manera confiable incluso niveles de parásitos muy bajos.
Lo Que Esto Significa para la Salud Pública
Los resultados de estas pruebas son esenciales para la salud pública en regiones donde la malaria es un problema. Con mejores métodos de detección, los trabajadores de la salud podrán identificar casos de malaria más precisamente, incluyendo aquellos que son asintomáticos o están presentes en niveles bajos.
Entender la verdadera extensión de la transmisión de malaria ayudará a planear estrategias de control y eliminación. Esto es especialmente importante en el sudeste asiático, donde la malaria zoonótica representa una amenaza significativa.
Desafíos por Delante
A pesar de estos resultados prometedores, todavía hay desafíos por superar. Aunque las nuevas pruebas muestran una detección mejorada, la necesidad de transcripción inversa añade complejidad y puede aumentar costos. Esto puede limitar su uso en entornos con recursos limitados. Además, la estabilidad del material genético en las muestras de sangre puede degradarse con el tiempo, haciendo necesario usar muestras frescas para obtener los mejores resultados.
Además, la investigación no incluyó todos los tipos posibles de malaria, lo que significa que algunos pueden seguir siendo más difíciles de detectar. La capacidad de diferenciar entre parásitos estrechamente relacionados sigue siendo un área importante para futuros estudios.
Conclusión
En resumen, los avances en los métodos de detección molecular para parásitos de malaria como P. knowlesi son vitales para controlar y prevenir la malaria, especialmente en regiones donde coexisten especies humanas y zoonóticas. El uso de técnicas que incluyen la transcripción inversa muestra un gran potencial para mejorar las capacidades de diagnóstico. A medida que estos métodos se perfeccionen, probablemente jugarán un papel clave en los esfuerzos globales para eliminar la malaria y proteger la salud pública. Una mejor detección de infecciones de bajo nivel conducirá, en última instancia, a una mejor comprensión de la dinámica de transmisión de la malaria y ayudará a informar estrategias efectivas para el control de la malaria.
Esta investigación continua es crucial para abordar los desafíos de salud pública que plantea la malaria en el sudeste asiático y garantizar que se puedan realizar diagnósticos precisos y oportunos para combatir la enfermedad de manera efectiva.
Título: Improved limit of detection for zoonotic Plasmodium knowlesi and P. cynomolgi surveillance using reverse transcription for total nucleic acid preserved samples or dried blood spots
Resumen: BackgroundZoonotic P. knowlesi and P. cynomolgi symptomatic and asymptomatic infections occur across endemic areas of Southeast Asia. Most infections are low-parasitemia, with an unknown proportion below routine microscopy detection thresholds. Molecular surveillance tools optimizing the limit of detection (LOD) would allow more accurate estimates of zoonotic malaria prevalence. MethodsAn established ultra-sensitive Plasmodium genus quantitative-PCR (qPCR) assay targeting the 18S rRNA gene underwent LOD evaluation with and without reverse transcription (RT) for P. knowlesi, P. cynomolgi and P. vivax using total nucleic acid preserved (DNA/RNA ShieldTM) isolates and archived dried blood spots (DBS). LODs for selected P. knowlesi-specific assays, and reference P. vivax- and P. cynomolgi-specific assays were determined with RT. Assay specificities were assessed using clinical malaria samples and malaria-negative controls. ResultsThe use of reverse transcription improved Plasmodium species detection by up to 10,000-fold (Plasmodium genus), 2759-fold (P. knowlesi), 1000-fold (P. vivax) and 10-fold (P. cynomolgi). The median LOD with RT for the Kamau et al. Plasmodium genus RT-qPCR assay was [≤]0.0002 parasites/{micro}L for P. knowlesi and 0.002 parasites/{micro}L for both P. cynomolgi and P. vivax. The LODs with RT for P. knowlesi-specific PCRs were: Imwong et al. 18S rRNA (0.0007 parasites/{micro}L); Divis et al. real-time 18S rRNA (0.0002 parasites/{micro}L); Lubis et al. hemi-nested SICAvar (1.1 parasites/{micro}L) and Lee et al. nested 18S rRNA (11 parasites/{micro}L). The LOD for P. vivax- and P. cynomolgi-specific assays with RT were 0.02 and 0.20 parasites/{micro}L respectively. For DBS P. knowlesi samples the median LOD for the Plasmodium genus qPCR with RT was 0.08, and without RT was 19.89 parasites/uL (249-fold change); no LOD improvement was demonstrated in DBS archived beyond 6 years. The Plasmodium genus and P. knowlesi-assays were 100% specific for Plasmodium species and P. knowlesi detection, respectively, from 190 clinical infections and 48 healthy controls. Reference P. vivax-specific primers demonstrated known cross-reactivity with P. cynomolgi. ConclusionOur findings support the use of an 18S rRNA Plasmodium genus qPCR and species-specific nested PCR protocol with RT for highly-sensitive surveillance of zoonotic and human Plasmodium species infections. Author SummaryThe monkey malaria parasite Plasmodium knowlesi has been found to increasingly infect humans across Southeast Asia via the bite of its anopheline mosquito vectors. Human infections with a similar monkey parasite, Plasmodium cynomologi, have also been reported. The diagnostic tools commonly used to detect these malaria species are often unable to detect very low-level infections. We aimed to to improve surveillance detection tools and blood sample collection methods to detect these zoonotic malaria species and understand the extent of transmission and the burden of disease. This study validated and compared the use of molecular laboratory assays targeting these species. We found that with the use of reverse transcription, large improvements in the limit of detection were possible, by up to 10,000-fold for initial malaria screening, and up to 2759-fold for specific P. knowlesi detection. Findings from this study support the use of ultrasensitive detection tools to improve surveillance approaches to emerging zoonotic malaria species.
Autores: Matthew J Grigg, K. A. Braima, K. A. Piera, I. N. Lubis, R. Noviyanti, G. S. Rajahram, P. Kariodimedjo, I. R. Nainggolan, R. Permatasari, L. Trianty, R. Amalia, S. S. Sakam, A. F. Tan, T. William, J. A. Westaway, P. C. Lee, S. Daim, H. Surendra, N. Christy, A. G. Letizia, C. L. Peatey, M. A. Moideen, B. Barber, C. J. Sutherland, N. M. Anstey
Última actualización: 2024-04-08 00:00:00
Idioma: English
Fuente URL: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2024.04.04.24305339
Fuente PDF: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2024.04.04.24305339.full.pdf
Licencia: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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