RAM-FISH: Una Nueva Forma de Estudiar el ARN

Los seres vivos compuestos por muchas células, como los animales y plantas, tienen sistemas complicados dentro de ellos. Estos sistemas son controlados por pequeñas moléculas conocidas como RNA. La forma en que estas moléculas de RNA aparecen en las células puede decirnos mucho sobre cómo se desarrollan los tejidos y cómo comienzan las enfermedades. Muchos científicos quieren encontrar maneras fáciles y confiables de ver múltiples moléculas de RNA en los tejidos sin complicar demasiado las cosas.

Para estudiar estas moléculas de RNA, los científicos necesitan métodos que funcionen bien y que no tomen demasiado tiempo o esfuerzo. También quieren asegurarse de poder mirar diferentes tipos de muestras sin mucha preparación. La tecnología reciente permite a los científicos revisar el RNA en células individuales mientras mantienen la estructura del tejido intacta. Hay dos métodos principales: uno que usa secuenciación y otro que utiliza sondas coloridas.

#Técnicas de Detección de RNA

#Métodos Basados en Secuenciación

Los métodos basados en secuenciación implican desarmar y leer las secuencias de RNA para averiguar qué genes están activos. Algunas técnicas populares incluyen:

• Visium: Este método permite el análisis espacial del RNA en los tejidos, proporcionando un mapa de la actividad génica.
• Stereo-seq: Esta técnica funciona de manera similar, pero tiene un enfoque diferente para capturar datos.
• Slide-seq: Este método captura señales de RNA usando una configuración de diapositiva específica.

#Métodos Basados en Imágenes

Los métodos basados en imágenes utilizan etiquetas fluorescentes especiales para marcar dónde está el RNA y cuánto hay. Algunas técnicas conocidas incluyen:

• MERFISH: Este método utiliza múltiples rondas de imágenes para recopilar datos de muchas moléculas de RNA a la vez.
• osmFISH: Ayuda a visualizar el RNA de una manera muy detallada.
• CosMx SMI: Este enfoque innovador rastrea RNA en muestras de tejido.
• STARmap: Esta técnica ofrece imágenes de alta resolución de dónde se encuentra el RNA en los tejidos.
• seq-FISH: Otro método que permite a los científicos ver las señales de RNA de manera muy clara.
• FISH&CHIPS: Este es un método más nuevo que funciona junto con otras técnicas.

Aunque estos métodos son útiles, a menudo vienen con problemas como pasos de preparación complicados, costos altos y el riesgo de obtener señales falsas.

#Mejoras en Métodos de Localización de RNA

Los científicos han encontrado mejores formas de amplificar señales y suprimir el ruido de fondo. Métodos como HCR3.0 y SABER-FISH han hecho posible ver señales más claramente y reducir la interferencia de fondo. Sin embargo, estas técnicas todavía tienen sus propios problemas, como:

1. Capacidad limitada para manejar muchos objetivos de RNA a la vez.
2. Tiempos experimentales largos.
3. Protocolos intensivos en mano de obra que necesitan manejo experto, lo que puede llevar a errores.

Algunos métodos nuevos, como cycleHCR y EASI-FISH, han mejorado la cantidad de objetivos que pueden manejar, pero requieren configuraciones complicadas y no son fáciles para todos los laboratorios de usar.

#RAM-FISH: Una Nueva Solución

¡Llega RAM-FISH! Este método combina técnicas avanzadas para detectar eficientemente más de 30 objetivos de RNA a la vez. Es más rápido y fácil que los métodos anteriores, lo que lo hace más accesible para los científicos. Anteriormente, los investigadores han probado este método en escalas de mariposa y cerebros de peces, y ahora se ha mejorado para permitir múltiples rondas de detección.

#Flujo de Trabajo de RAM-FISH

El flujo de trabajo para RAM-FISH es sencillo. Comienza con la preparación de muestras de tejido, que se puede hacer manualmente o usando sistemas automatizados. Después de recoger los tejidos, los científicos los fijan y permeabilizan. Luego, hacen la prueba ellos mismos o dejan que las máquinas lo manejen.

Los pasos básicos incluyen:

1. Recolección de Tejidos: Primero, los científicos toman muestras del organismo, ya sea una mariposa o un pez.
2. Fijación y Preparación: Los tejidos se tratan para hacerlos más fáciles de trabajar y para mantener las células intactas.
3. Sondeo del RNA: Luego, usan sondas especiales que se unen al RNA de interés. Después, usan sondas adicionales para amplificar las señales que quieren ver.
4. Imágenes: Finalmente, las muestras se examinan bajo un microscopio especial para capturar las señales de RNA.

En la configuración manual, los pasos de hibridación, lavado y eliminación de señales ocurren principalmente en placas de vidrio o tubos pequeños. El enfoque automatizado utiliza un sistema fluidico para agilizar el proceso, haciéndolo más eficiente.

#Preparación de Sondas

Para preparar sondas para detectar RNA, los investigadores crearon plantillas útiles de Excel. Estas plantillas ayudan a diseñar oligonucleótidos que pueden unirse al RNA específico que quieren estudiar. Usan una secuencia de gen de bases de datos y preparan las sondas para asegurar que se unan correctamente.

#Aplicaciones Prácticas de RAM-FISH

#Investigación de Mariposas

Una aplicación emocionante de RAM-FISH es observar el desarrollo de las alas de mariposas. Las mariposas tienen patrones de color únicos que cambian a medida que crecen. Los científicos han estudiado hasta 33 genes en diferentes etapas de desarrollo para ver cómo se comportan.

Por ejemplo:

• Wnt1, Wnt6 y Wnt10: Estos genes mostraron patrones consistentes relacionados con los márgenes y manchas de las alas, coincidiendo con estudios anteriores.
• Cubitus interruptus (ci): Este gen se encontró en ciertas áreas de la ala, lo que se alinea con trabajos previos.

Usar RAM-FISH permitió a los investigadores ver cuán compleja es la expresión génica durante el desarrollo de la mariposa, ayudando a entender su crecimiento y patrones de color.

#Estudios del Cerebro de Zebrafish

Las larvas de zebrafish son otro gran ejemplo de RAM-FISH en acción. Debido a su estructura simple y transparencia, los zebrafish son ideales para estudiar cómo funcionan los genes en el cerebro durante las primeras etapas de la vida. Los investigadores utilizaron RAM-FISH para verificar cómo se expresa ciertos genes en sus cerebros, lo cual es importante para entender comportamientos.

Por ejemplo, se examinaron varios genes relacionados con la función nerviosa, mostrando dónde y cómo están activos. Esto ayuda a construir un panorama más claro de la función y desarrollo del cerebro.

#Desafíos y Análisis de Robustez

Aunque RAM-FISH es una herramienta poderosa, los científicos necesitaban abordar algunos desafíos, como asegurarse de que las señales permanezcan fuertes a través de múltiples ciclos de detección. Miraron específicamente el gen optomotor-blind (omb) para analizar cómo se degrada la señal con el tiempo.

Para probar la fiabilidad del método, compararon imágenes tomadas después de diferentes rondas de detección. Encontraron que aunque puede haber cierta pérdida de señal, los patrones generales permanecieron claros, apoyando la robustez del método RAM-FISH.

#Conclusión

RAM-FISH representa un avance emocionante en el campo de la detección y localización de RNA. Proporciona una manera más simple, rápida y confiable de estudiar la expresión génica en varios organismos. Ya sea desentrañando los secretos del desarrollo de las alas de mariposa o proporcionando conocimientos sobre los cerebros de zebrafish, este método tiene el potencial de revolucionar cómo los científicos exploran el mundo de la expresión génica.

En el paisaje en constante cambio de la investigación científica, RAM-FISH promete para muchos investigadores que buscan métodos eficientes para desbloquear el fascinante mundo del RNA y su papel en los procesos de la vida. Con esta herramienta en su arsenal, es probable que los científicos hagan descubrimientos que mejoren nuestra comprensión de la biología, el desarrollo y las enfermedades de maneras que solo podemos anticipar.

Así que mantengamos los ojos abiertos; ¡quién sabe qué hallazgos increíbles nos esperan con este nuevo enfoque al estudio del RNA!