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# Biología # Microbiología

Nuevo método de prueba para la fiebre porcina africana

Se está desarrollando una herramienta prometedora para detectar rápidamente la PPA en cerdos.

Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski

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Método de detección de Método de detección de ASF más rápido resultados rápidos. Nueva prueba combina RPA y CRISPR para
Tabla de contenidos

La Fiebre Porcina Africana (FPA) es una enfermedad viral que afecta a los cerdos, tanto domésticos como salvajes. Esta enfermedad es causada por un virus conocido como el Virus de la Fiebre Porcina Africana (FPA). Pertenece a un grupo de virus que son conocidos por su estructura compleja. El FPA tiene una gran cantidad de material genético, específicamente ADN de doble cadena, y puede producir más de 160 proteínas diferentes que lo ayudan a funcionar.

La FPA es famosa por ser muy contagiosa. Esto significa que si un cerdo se infecta, puede propagarse rápidamente a otros, creando problemas serios para los granjeros. El FPA puede transmitirse de cerdo a cerdo a través del contacto directo, pero también puede sobrevivir fuera de los cerdos por mucho tiempo. Puede quedarse en el ambiente, en el alimento, en equipos, o incluso en la ropa. Por esto, el virus puede causar grandes preocupaciones para la industria del cerdo a nivel mundial.

Los cerdos infectados pueden mostrar una variedad de síntomas. A menudo desarrollan fiebre alta y pueden volverse letárgicos, perder el apetito, vomitar, tener diarrea e incluso sufrir de sangrado y dificultades para respirar. En casos donde la infección es grave, los cerdos pueden morir rápidamente, a veces dentro de una semana, y la tasa de mortalidad puede llegar al 100%.

Orígenes y Propagación de la FPA

Se cree que la FPA comenzó en África subsahariana, donde el virus todavía está presente entre las poblaciones locales de cerdos. Con los años, han ocurrido brotes en Europa y América, aunque muchos de estos se controlaron eventualmente.

Un brote significativo ocurrió en Georgia en 2007, llevando al virus a volverse común entre las poblaciones de jabalíes en Europa del Este. Durante más de una década, la FPA se mantuvo bastante contenida hasta que se violaron las medidas de bioseguridad, permitiendo su rápida propagación a China en 2018. Este brote tuvo efectos dramáticos, causando un colapso en la industria de cría de cerdos del país.

En 2021, el virus fue detectado en la isla caribeña de La Española, y este brote aún está en curso, lo que genera preocupaciones para países como Estados Unidos. Para combatir esta amenaza, EE. UU. ha intensificado sus esfuerzos para monitorear y controlar la FPA. Han implementado medidas estrictas para prevenir el movimiento de carne de cerdo y productos relacionados desde territorios afectados, con la esperanza de proteger su población de cerdos domésticos.

La Necesidad de un Diagnóstico Eficaz

Dado el grave impacto de la FPA, la detección rápida y precisa es vital. Los métodos tradicionales como QPCR (que significa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) son actualmente el estándar de oro para diagnosticar el FPA. Sin embargo, qPCR requiere equipo costoso, capacitación especial y configuraciones de laboratorio específicas, lo que lo hace poco práctico para áreas con recursos limitados.

Se han desarrollado métodos alternativos como RPA (amplificación por polimerasa recombinante) y LAMP (amplificación isoterma mediada por bucle), pero no igualan la precisión de qPCR. Esto es como intentar atrapar un animal rápido con una red más lenta. El desafío está en crear pruebas que sean tan buenas como qPCR, pero lo suficientemente simples para que cualquiera las use, incluso en áreas remotas.

Un Enfoque Innovador: Tecnología CRISPR

Recientemente, una nueva técnica llamada CRISPR ha hecho ruido en muchos campos, incluida la ingeniería genética y la medicina. Esta tecnología tiene el potencial de adaptarse para diagnosticar enfermedades, incluida la FPA.

Al combinar CRISPR con RPA, los investigadores están tratando de desarrollar pruebas más rápidas y sencillas que se puedan usar justo en el lugar donde se mantienen los cerdos. Este enfoque dual podría ayudar a los granjeros a identificar rápidamente las infecciones y prevenir brotes más grandes.

Desarrollo de un Nuevo Método de Prueba

En esta investigación, los científicos se centraron en crear una nueva prueba para el FPA utilizando RPA junto con la tecnología CRISPR. Primero, seleccionaron pequeños fragmentos de ARN diseñados para dirigirse al FPA. Esto implicó probar cuán efectivos eran estos fragmentos para reconocer el virus.

Después de confirmar que la nueva prueba podía identificar el FPA con precisión, se aseguraron de que funcionara bien con varias muestras, desde hisopos de sangre hasta otros materiales biológicos. El nuevo método buscaba proporcionar resultados que coincidieran con los obtenidos a través de las pruebas tradicionales de qPCR, confirmando así su fiabilidad.

Cómo Funciona la Nueva Prueba

La prueba desarrollada es un proceso simple de dos pasos. En el primer paso, RPA amplifica el material genético del virus si está presente en la muestra. Este paso se lleva a cabo a una temperatura constante, lo que facilita su manejo.

Una vez que se amplifica el material genético, entra en juego CRISPR. El sistema CRISPR reconoce y etiqueta el material viral amplificado y emite una señal fluorescente. Si la prueba funciona, el área de prueba se ilumina, similar a cómo se enciende una bombilla al accionar el interruptor. Esta señal visual es especialmente útil, ya que permite comprobaciones rápidas sin necesidad de configuraciones de laboratorio complejas.

Pruebas del Nuevo Método

Para asegurarse de que la nueva prueba funcione correctamente, los investigadores realizaron ensayos extensivos. Prepararon muestras de control positivo que contenían ADN del FPA y las probaron junto a muestras de otros virus para confirmar que el nuevo método no estaba identificando erróneamente otras infecciones virales como FPA.

Los investigadores también evaluaron qué tan bien funcionaba el método bajo diferentes condiciones, incluyendo el uso de varios tipos de muestras en las que podrían ser probados los cerdos. Incluso añadieron concentraciones conocidas de ADN del FPA para ver si la prueba podía detectarlo de manera fiable, lo cual sí pudo.

Evaluación de la Eficacia

En estos ensayos, el nuevo método demostró un sólido rendimiento. La prueba pudo identificar con precisión el FPA tanto en condiciones controladas como en muestras reales tomadas de cerdos sospechosos de estar infectados. Los resultados mostraron un impresionante nivel de fiabilidad, coincidiendo con los hallazgos de qPCR, y resaltando lo útil que podría ser este método en el campo.

¿Por Qué Esto Es Importante?

El desarrollo de esta nueva prueba es crucial porque proporciona una herramienta esencial para los granjeros y veterinarios. En caso de un brote de FPA, una prueba rápida y fiable puede ayudar en la detección y control tempranos. Un diagnóstico rápido significa que se pueden tomar acciones más rápidas para prevenir la propagación del virus.

Esta innovación puede ser especialmente beneficiosa en áreas donde los recursos y el acceso a instalaciones de laboratorio son limitados. Al empoderar a aquellos en la primera línea de la cría de cerdos, esta prueba podría ayudar a proteger la industria de los efectos devastadores de la FPA.

Conclusión

En resumen, el aumento de la FPA plantea un desafío significativo para la cría de cerdos a nivel global, afectando el suministro de alimentos y la estabilidad económica. El desarrollo de un método de prueba simple y eficaz que combine RPA y CRISPR podría cambiar la forma en que abordamos esta enfermedad.

Con una herramienta rápida y precisa para diagnosticar la FPA, podríamos ver una disminución en los brotes y un riesgo reducido para las poblaciones de cerdos. A veces, se necesita un poco de creatividad e innovación—como mezclar ciencia con un toque de humor—para superar desafíos. Los científicos continúan trabajando para doblar la curva de la propagación de enfermedades, haciendo del mundo un lugar más seguro para nuestros amigos de cuatro patas y los granjeros que se preocupan por ellos.

Fuente original

Título: Rapid identification of African swine fever virus in diagnostic samples using CRISPR-Cas

Resumen: African Swine Fever Virus (ASFV) is a high consequence, highly transmissible pathogen affecting swine causing African Swine Fever (ASF), a devastating disease, with high mortality rates in naive populations. Due to the likelihood of significant economic impacts associated with an ASF outbreak, considerable resources have been allocated in the United States (U.S.) to safeguard the swine industry against this threat. Ongoing outbreaks of ASF in the Dominican Republic and Haiti further threaten U.S. swine due to their proximity and involvement in movement to and from North America. While surveillance programs are ongoing, there are limited point-of-care (POC) tests available during outbreaks that maintain the sensitivity and specificity standards of laboratory testing (e.g., qPCR). However, the recently developed CRISPR-Cas testing systems may provide comparable high-quality results. In a CRISPR-based diagnostic assay, CRISPR effectors can be programmed with CRISPR-RNA (crRNA) to target specific DNA or RNA. Upon target binding, the Cas enzyme undergoes collateral cleavage of nearby fluorescently quenched reporter molecules (ssDNA or ssRNA), which can be detected under blue light or a fluorescence microplate reader. Furthermore, this tool is rapid, simple, cost-effective and can be performed with inexpensive equipment. For these reasons, we sought to develop a low-cost visual detection method for ASFV by employing the recombinase polymerase amplification (RPA)-dependent CRISPR-Cas12a technique that can be utilized in the field as a point-of-care-assay. Our CRISPR-Cas12a assay demonstrated comparable sensitivity and specificity to qPCR, both visually and when quantified using a fluorescent reader. In whole blood samples from ASFV-suspect or ASFV-negative cases, the CRISPR assay achieved a sensitivity of 98.3% (102 DNA copies) and a specificity of 100%. Finally, an assessment of the reaction time constraints indicated that results can be visualized in as little as seven minutes with a peak fluorescence at 40 min (RPA and CRISPR steps). The results of this feasibility assay validation allow for the rapid development of sensitive and specific POC tests that may be used for outbreak response in the future.

Autores: Sekhar Kambakam, Julia Thomas, Suelee Robbe-Austerman, Karthik Shanmuganatham, Rachel Palinski

Última actualización: 2024-12-30 00:00:00

Idioma: English

Fuente URL: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508

Fuente PDF: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.27.630508.full.pdf

Licencia: https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/

Cambios: Este resumen se ha elaborado con la ayuda de AI y puede contener imprecisiones. Para obtener información precisa, consulte los documentos originales enlazados aquí.

Gracias a biorxiv por el uso de su interoperabilidad de acceso abierto.

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