Aprimorando Estudos de Interação de Proteínas com TurboID

A espectrometria de massa com rotulagem por proximidade (PL-MS) é um método útil que ajuda os cientistas a estudar como as Proteínas interagem entre si, como elas estão distribuídas nas células e como se conectam com RNA e DNA. Uma variante utilizada em estudos é o TurboID, que é uma enzima modificada que funciona muito bem para marcar proteínas próximas com Biotina, um tipo de vitamina que se liga fortemente a esferas específicas.

#Como o TurboID Funciona

O TurboID pode ser ligado a uma proteína que os cientistas querem estudar. Quando o TurboID está presente nas células, ele marca proteínas próximas com biotina. Depois desse processo de marcação, os cientistas podem usar esferas especiais que agarram a biotina, puxando as proteínas marcadas da mistura. Esse método facilita a identificação das interações entre proteínas porque elas não precisam permanecer juntas durante o processo de purificação, tornando o PL-MS mais sensível do que métodos mais antigos.

#Usos Atuais e Limitações do PL-MS

O PL-MS é popular porque é versátil e consegue reunir muitas informações rapidamente. Porém, ainda pode ter problemas, especialmente ao lidar com pequenas quantidades de certas proteínas ou com suas ligações fracas com outras proteínas. Às vezes, os dados coletados podem incluir muitas proteínas indesejadas, dificultando a identificação das interações específicas que os pesquisadores estão interessados.

Para contornar esse problema, os pesquisadores tentaram várias abordagens para marcar as proteínas. A maioria dos estudos focou na marcação no nível da proteína, que é geralmente considerada mais confiável. Contudo, houve menos estudos olhando especificamente para a marcação no nível do peptídeo. Esse método identifica diretamente as partes das proteínas marcadas com biotina, o que pode reduzir erros causados pelo ruído de fundo de outras proteínas.

#Objetivos da Pesquisa

No nosso estudo, buscamos melhorar a sensibilidade do PL-MS tentando aprimorar como as proteínas são marcadas no nível do peptídeo. Usamos o TurboID junto com uma proteína chamada SPY, que é conhecida por estar em baixas quantidades e ter interações breves com outras proteínas. Nossa pesquisa anterior já havia identificado alvos associados ao SPY, nos dando uma base sólida para trabalhar.

Para aumentar a sensibilidade, testamos diferentes tipos de esferas, concentrações de biotina e métodos de lavagem durante o processo de extração de proteínas. Comparamos os resultados das enriquecimentos no nível da proteína e no nível do peptídeo para ver como eles se saíram na detecção de alvos conhecidos e novos interatores.

#Comparação de Fluxos de Trabalho e Linhas Selecionadas

Para testar nossos métodos, usamos uma linha específica de plantas conhecida como SPY-TurboID. Essa proteína ajuda as plantas de várias maneiras, e queríamos ver quão eficaz ela seria em nossos experimentos. Verificamos cuidadosamente para garantir que nossa proteína de fusão TurboID funcionasse bem no sistema da planta.

Depois de confirmar sua função, tratamos as plantas SPY-TurboID com diferentes concentrações de biotina e analisamos quais proteínas foram marcadas. Notamos que a quantidade de proteínas marcadas não aumentou significativamente com concentrações mais altas de biotina, sugerindo interações fracas ou baixas quantidades de algumas proteínas.

#Avaliação de Diferentes Tipos de Esferas

Então avaliamos vários tipos de esferas pela sua capacidade de enriquecer proteínas biotiniladas. As esferas M280 de estreptavidina mostraram o melhor desempenho na captura de proteínas marcadas com biotina, levando a um maior número de interações identificadas. Também testamos um método baseado em anticorpos, mas achamos menos eficaz porque capturava mais proteínas de fundo.

Usando as esferas M280, realizamos experimentos com diferentes concentrações de biotina e técnicas de lavagem mais eficazes. Isso nos permitiu capturar seletivamente as proteínas que nos interessavam, enquanto reduzíamos a interferência de proteínas indesejadas.

#Aumentando a Detecção e Quantificação

Para aumentar ainda mais a detecção dos interatores do SPY, testamos concentrações mais altas de biotina durante nosso processo de marcação. Surpreendentemente, descobrimos que usar 500 µM de biotina resultou em uma melhor detecção de proteínas biotiniladas em comparação com os 50 µM padrão. A maior concentração gerou resultados mais confiáveis e robustos, destacando sua importância em nossos experimentos.

Também comparamos duas ferramentas de software para análise de dados-Maxquant e MSFragger. O MSFragger consistentemente apresentou melhor desempenho na detecção de peptídeos biotinilados, permitindo identificar mais proteínas relacionadas ao SPY.

#Otimizando Procedimentos de Lavagem

Durante nossos experimentos, encontramos um problema chamado colapso de esferas, que ocorre quando as esferas grudam nas paredes dos tubos, impedindo a recuperação completa da amostra. Para resolver isso, modificamos os passos de lavagem em nossos procedimentos. Ao evitar certas soluções de lavagem, minimizamos o colapso das esferas e melhoramos nossa recuperação geral de amostras.

Depois de ajustar os procedimentos de lavagem, descobrimos que conseguimos identificar mais proteínas das amostras SPY-TurboID usando tanto o Maxquant quanto o MSFragger. Isso foi um passo significativo para tornar o processo PL-MS mais eficiente e confiável.

#Comparando Enriquecimentos no Nível do Peptídeo e da Proteína

Após realizar nossos experimentos, comparamos os resultados dos enriquecimentos no nível do peptídeo e da proteína. Curiosamente, ambos os métodos forneceram percepções únicas sobre as proteínas que interagiram com o SPY. Enquanto o enriquecimento no nível da proteína identificou mais alvos conhecidos, o enriquecimento no nível do peptídeo revelou interatores novos adicionais. Essa relação complementar destaca a importância de usar ambas as técnicas em conjunto.

#Efeitos nos Níveis da Proteína Nucleoporina

Outro foco do nosso estudo foi entender se o SPY influenciava os níveis de proteínas específicas conhecidas como Nucleoporinas, que têm um papel no transporte de materiais para dentro e fora do núcleo nas células. Empregamos uma técnica chamada rotulagem por isótopo estável para avaliar como o SPY afeta os níveis de nucleoporinas em certas plantas mutantes. Nossos achados sugeriram que várias proteínas nucleoporinas estavam presentes em quantidades menores nas plantas mutantes do SPY em comparação com as normais.

#Conclusão

Em resumo, nosso estudo conseguiu aprimorar os métodos usados no PL-MS para estudar interações de proteínas. Ao testar várias abordagens, identificamos 60 alvos conhecidos e 100 novos interatores conectados ao SPY. Essas descobertas iluminam a complexidade das interações proteicas nas células e enfatizam como técnicas melhoradas podem levar a novos conhecimentos na pesquisa biológica.

O trabalho que realizamos pode ser aplicado não só a diferentes proteínas e contextos, mas também oferece potencial para futuras pesquisas sobre a dinâmica das interações proteicas em vários processos biológicos. Embora tenhamos feito melhorias significativas, reconhecemos os desafios que permanecem, incluindo o ruído de fundo e potenciais interações perdidas. Com os avanços contínuos, esperamos refinar ainda mais esses métodos e estender suas aplicações na biologia celular.