Novas descobertas sobre a oclusão da artéria retinal com o modelo UPOAO

A oclusão da artéria retinal (OAR) é uma condição séria nos olhos que acontece quando o fluxo sanguíneo na artéria retinal para de repente. Essa falta de fluxo pode causar danos à retina, resultando em problemas de visão. Muitas pessoas com OAR podem ter dificuldade para enxergar, com algumas perdendo a visão completamente. Além dos problemas de visão, quem tem OAR também tem mais chances de ter problemas cardíacos e cerebrais. Se o fluxo sanguíneo não for restaurado rapidamente, a retina pode começar a morrer em até 90 minutos por falta de oxigênio e nutrientes.

Atualmente, os tratamentos existentes para OAR, como massagem ocular e terapia hiperbárica de oxigênio, não ajudam muito. Tem um tratamento chamado trombólise, que pode restaurar o fluxo sanguíneo de forma eficaz, mas precisa ser feito rápido-geralmente dentro de 4,5 horas após o evento. Contudo, restaurar o fluxo às vezes pode causar mais danos do que benefícios, levando a uma condição chamada lesão por isquemia-reperfusão (LIR), que pode resultar em inflamação e danos à retina.

Para estudar a OAR e encontrar tratamentos melhores, os pesquisadores precisam de modelos animais confiáveis que imitem bem essa condição. Vários modelos animais foram desenvolvidos para analisar os efeitos dos danos na retina causados pela redução do fluxo sanguíneo e pela posterior restauração. Esses modelos podem ser divididos em duas categorias: modelos de oclusão intravascular e modelos de oclusão extravascular.

Os modelos intravasculares envolvem bloquear o fluxo sanguíneo dentro dos vasos, enquanto os modelos extravasculares cortam o fluxo sanguíneo de fora dos vasos. Alguns modelos comuns incluem métodos que bloqueiam diretamente a artéria retinal central ou que envolvem o bloqueio da artéria carótida comum. Cada modelo tem suas vantagens e desvantagens. Por exemplo, alguns métodos requerem técnicos altamente qualificados para realizá-los, enquanto outros podem causar complicações, como danos adicionais ao nervo óptico ou podem não imitar adequadamente as condições vistas na OAR.

Diante desses desafios, há uma necessidade de um modelo animal mais simples que possa simular efetivamente os efeitos agudos da OAR. Neste estudo, buscamos desenvolver um novo modelo em camundongos chamado modelo de oclusão da artéria oftálmica pterigopalatina unilateral (OAPOU), que nos permite estudar os efeitos da isquemia retinal e a restauração subsequente do fluxo sanguíneo.

#Criando o Modelo OAPOU

Usamos camundongos machos de oito semanas para nossos experimentos, evitando os efeitos dos hormônios femininos. Para preparar os camundongos para o procedimento cirúrgico, colocamos eles sob anestesia e mantivemos a temperatura corporal estável. Fizemos uma incisão cuidadosa na região do pescoço e isolamos as artérias relevantes para o procedimento.

Um fio de silicone especial foi inserido para bloquear o fluxo sanguíneo para a retina. Esse fio de silicone funciona como um tampão, impedindo que o sangue chegue ao olho. Assim que o fio estava no lugar, esperávamos um tempo pré-determinado para permitir que a isquemia ocorresse. Após esse período, o fio seria removido para restaurar o fluxo sanguíneo. Todo o processo cirúrgico é realizado com cuidado para minimizar os danos aos camundongos e garantir resultados precisos.

#Avaliando os Danos

Depois de completar o modelo, procuramos sinais de danos na retina. Para visualizar os vasos sanguíneos na retina, injetamos um corante e examinamos os olhos usando um microscópio especial. Isso nos permitiu ver se o fluxo sanguíneo tinha sido bloqueado e restaurado com sucesso.

Depois, estudamos como diferentes durações de isquemia e reperfusão afetavam a retina. Por exemplo, testamos duas durações isquêmicas: 30 minutos e 60 minutos, seguidas por períodos de reperfusão de 3 ou 7 dias. Avaliamos os danos observando o número de Células Ganglionares da Retina sobreviventes (CGRs) e testando a função visual usando medições de eletroretinograma (ERG).

Nossos resultados mostraram que após 30 minutos de isquemia, não houve muitos danos, mas após 60 minutos de isquemia, observamos uma diminuição significativa nas CGRs e uma queda na função visual. Isso indica que períodos mais longos de isquemia resultam em danos mais severos à retina, confirmando que o modelo OAPOU representa efetivamente os efeitos da OAR.

#Mudanças na Estrutura Retinal

Para avaliar melhor as mudanças estruturais na retina, utilizamos a tomografia de coerência óptica (OCT). Essa técnica não invasiva nos permite medir a espessura da retina. No nosso modelo, medimos a espessura da retina após 3 e 7 dias de reperfusão.

Após 3 dias, houve mudanças menores, mas um afinamento significativo foi notado após 7 dias de reperfusão. Esse afinamento envolveu particularmente as camadas internas da retina, onde as CGRs estão localizadas. Também utilizamos técnicas histológicas, onde manchamos seções da retina para analisar sua estrutura. Essa análise confirmou nossos achados de OCT, revelando que as camadas internas da retina sofreram mais danos ao longo do tempo.

#Impacto nas Células Retinais

Na nossa investigação, também examinamos tipos específicos de células retinais. Essas incluem células bipolares, fotorreceptores, células horizontais e células amacrinas. Descobrimos que as células bipolares mostraram uma redução significativa em número após 7 dias de reperfusão. No entanto, os fotorreceptores pareceram ser mais resistentes, permanecendo em sua maioria estáveis durante o mesmo período.

As células horizontais e as células amacrinas colinérgicas mostraram perda celular notável após 3 e 7 dias de reperfusão, indicando que essas células também são afetadas pela isquemia retinal e pela subsequente restauração do fluxo sanguíneo.

#Análise do Transcriptoma

Para explorar mais a fundo as mudanças moleculares que ocorrem na retina durante esses processos, realizamos uma análise do transcriptoma. Essa análise nos ajuda a entender como diferentes genes são expressos na retina durante a isquemia e a reperfusão.

Coletamos amostras da retina e sequenciamos seu RNA para identificar genes que foram ativados ou desativados em diferentes momentos. Na fase inicial sem reperfusão, muitos genes relacionados à resposta imunológica foram regulados para cima. Isso sugere que há uma reação imunológica significativa ocorrendo nos estágios iniciais da isquemia.

Conforme o tempo progrediu para o período de reperfusão, observamos que genes relacionados ao estresse oxidativo e à inflamação se tornaram mais proeminentes. Isso é crítico porque o estresse oxidativo é conhecido por contribuir para danos celulares em várias condições, incluindo OAR.

Após 7 dias de reperfusão, notamos uma mudança em direção à regulação imunológica e vias relacionadas à inflamação na nossa análise transcriptômica. Isso sugere que, à medida que a retina sofre eventos isquêmicos, a resposta imunológica se torna mais ativa e pode causar danos adicionais ao tecido retinal.

#Papel das Células Imunes

A resposta imunológica desempenha um papel crucial nos danos causados pela isquemia retinal. Nossos achados demonstraram um aumento no número de leucócitos (um tipo de glóbulo branco) infiltrando a retina após a isquemia. Um dia após a oclusão, observamos muitos desses leucócitos no tecido retinal, que provavelmente migraram da corrente sanguínea devido aos danos isquêmicos.

Além disso, examinamos a ativação das células microgliais, que são as principais células imunes na retina. Após 3 e 7 dias de reperfusão, encontramos um aumento significativo no número de microglia ativadas. Isso indica que a resposta imunológica, envolvendo tanto células microgliais residentes quanto leucócitos infiltrantes, contribui para danos na retina durante a fase de recuperação.

#Comparação com Outros Modelos

Para avaliar a singularidade do nosso modelo OAPOU, o comparamos com outros modelos comumente usados para estudar a isquemia retinal, como o modelo de alta pressão intraocular (HIPO) e o modelo de oclusão da artéria carótida comum unilateral (OACCU). Enquanto ambos os modelos fornecem uma visão dos danos isquêmicos na retina, eles apresentam características diferentes.

O modelo HIPO é usado principalmente para glaucoma de fechamento angular primário e mostra efeitos semelhantes ao modelo OAPOU; no entanto, também resulta em danos às camadas externas da retina que não vimos no nosso modelo. O modelo OACCU representa principalmente a hipoperfusão retinal crônica e não emula os eventos isquêmicos agudos vistos em pacientes com OAR tão efetivamente quanto o modelo OAPOU.

Nossa análise transcriptômica revelou que o modelo OAPOU possui assinaturas de expressão genética distintas em comparação com os outros modelos, particularmente em metabolismo lipídico e respostas inflamatórias. Essas diferenças sugerem que cada modelo tem um mecanismo de ação único e pode destacar diferentes aspectos da lesão retinal e da recuperação.

#Conclusão

Em resumo, desenvolvemos com sucesso um novo modelo em camundongos chamado modelo OAPOU para estudar a oclusão da artéria retinal e seus efeitos na retina. O modelo imita os eventos isquêmicos agudos observados em pacientes com OAR e permite que os pesquisadores investiguem os processos patofisiológicos associados.

Por meio de nossos experimentos, observamos como diferentes durações de isquemia e reperfusão impactam a estrutura e a função retinal, destacando o papel crítico das respostas imunológicas na retinopatia. Os insights obtidos dessa pesquisa ajudarão a entender a patologia da OAR e podem abrir caminho para futuras estratégias terapêuticas voltadas a proteger a retina de lesões isquêmicas.

Esse modelo fornece uma plataforma eficaz para estudos adicionais com o objetivo de identificar tratamentos potenciais para OAR e doenças oculares relacionadas, com o objetivo final de melhorar os resultados visuais para pacientes que sofrem com essa condição.