Controlli RNA innovativi per il test dei virus

La pandemia di Coronavirus ha creato una grande necessità di test rapidi per rilevare il virus nelle persone. Tecniche chiamate RT-PCR in tempo reale e RT-LAMP si sono dimostrate strumenti precisi per diagnosticare il virus.

Per trovare i virus con successo, è importante avere misure di controllo qualità. Questo include il controllo dei test che utilizzano metodi avanzati di sequenziamento e amplificazione come RT-PCR e RT-LAMP. Normalmente, i controlli basati su materiale virale di pazienti infetti o virus vivi presentano problemi di sicurezza. Per evitare questi rischi, si possono creare controlli con RNA sintetico, che aiutano a testare diversi ceppi virali in modo sicuro. Inoltre, dato che la tecnologia per produrre DNA è comune, nuovi controlli RNA possono essere sviluppati rapidamente se compaiono nuovi ceppi virali.

Tuttavia, l'RNA non è molto stabile. Può deteriorarsi rapidamente quando è bagnato o asciutto. Questo rende difficile per i laboratori che necessitano di grandi quantità di RNA di controllo. Imagene ha un metodo che tiene al sicuro l'RNA. Comporta l'essiccazione dell'RNA e la sua collocazione in capsule speciali riempite con gas argon. Questo processo aiuta a immagazzinare e spedire l'RNA in sicurezza a temperatura ambiente.

In questo studio, abbiamo utilizzato controlli RNA sintetici creati da Twist Bioscience. Questi controlli sono stati distribuiti a cinque laboratori diversi per testarne l'efficacia. L'obiettivo era assicurarsi che i test potessero rilevare il virus in modo affidabile e che l'RNA potesse rimanere stabile per almeno 10 anni a temperatura ambiente. Abbiamo utilizzato vari dispositivi e kit RT-PCR per testare tre varianti diverse del virus e cinque obiettivi genici.

#Materiali e Metodi

I campioni di RNA realizzati da Twist Bioscience sono stati spediti su ghiaccio secco a Imagene. Parte di questi campioni è stata inviata a Bordeaux CHU così com'era, mentre l'altra parte è stata incapsulata. Alcuni dei campioni incapsulati sono stati riscaldati per simulare 10 anni di stoccaggio a temperatura ambiente. Le aliquote rimanenti sono stati inviate a Bordeaux, Limoges, Poitiers CHUs, CIRAD Réunion e un laboratorio privato a Salon de Provence.

#Preparazione del Controllo RNA

Le molecole di RNA sintetico SARS-CoV-2 fornite da Twist Bioscience sono state preparate in soluzioni da 100 μL. Queste sono state suddivise in porzioni più piccole e conservate a -80°C. Dopo lo scongelamento, l'RNA è stato diluito con una soluzione di stabilizzazione speciale prima di essere messo in capsule di vetro.

L'RNA è stato poi essiccato e incapsulato utilizzando gas argon. Un insieme di capsule per ogni variante di RNA è stato riscaldato automaticamente per simulare lo stoccaggio a lungo termine. Le capsule sono state poi inviate ai laboratori a temperatura ambiente.

#Testing dell'RNA

Per utilizzare le RNAshells®, le abbiamo aperte con uno strumento speciale e aggiunto acqua per reidratare l'RNA. Dopo una breve attesa, l'RNA era pronto per i test utilizzando metodi RT-qPCR o RT-LAMP.

Abbiamo anche preparato campioni di RNA standard che sono stati inviati a Bordeaux CHU. Questi campioni sono stati confrontati con l'RNA reidratato dalle capsule.

#Controllo di Contaminazione

Per verificare la contaminazione da DNA nei campioni di RNA, sono stati effettuati test senza la trascrittasi inversa. Questi test hanno trovato una leggera contaminazione da DNA in un campione di RNA, ma non era sufficiente per influenzare i risultati.

#Analisi RT-qPCR

Tutti i campioni di controllo hanno dato esito positivo. I segnali di amplificazione erano coerenti tra diverse varianti di RNA. Le differenze nei risultati erano principalmente dovute a variazioni negli specifici obiettivi genici testati.

#Test di Stabilità dell'RNA

Per confermare che l'Incapsulamento non avesse danneggiato l'RNA e che potesse durare a lungo, abbiamo controllato campioni incapsulati che erano stati riscaldati. Tutti i campioni hanno funzionato bene, dimostrando che potevano essere conservati a temperatura ambiente senza perdere efficacia.

Abbiamo anche testato la stabilità dell'RNA incapsulato per tre anni a temperatura ambiente rispetto ai campioni conservati congelati. I risultati non hanno mostrato differenze significative nella stabilità dell'RNA.

#Test di Compatibilità

Per assicurarci che i controlli potessero essere utilizzati con diversi metodi di test, abbiamo inviato capsule a laboratori che utilizzavano varie tecniche RT-PCR. I risultati sono stati coerenti, indicando che i controlli hanno funzionato bene su diversi sistemi.

Allo stesso modo, l'RNA è stato testato in una procedura RT-LAMP, che ha mostrato anch'essa risultati positivi.

#Applicazione Reale dei Controlli

Per l'uso nella vita reale, l'RNA incapsulato è stato utilizzato come controllo positivo in test sul campo. È stato incluso in molti test effettuati in diversi siti ed ha funzionato bene, amplificandosi con successo ogni volta.

Anche un laboratorio clinico privato è stato coinvolto. Hanno ricevuto le capsule e le istruzioni per l'uso. I risultati hanno mostrato che i controlli RNA incapsulati hanno funzionato bene, anche se due campioni hanno avuto variabilità a causa di un volume d'acqua improprio durante la reidratazione.

#Conclusione

Questo studio mirava a dimostrare che i controlli RNA incapsulati sono utili per rilevare il SARS-CoV-2. Sia basse che alte copie di RNA erano efficaci per i test utilizzando metodi RT-qPCR e RT-LAMP. I controlli hanno fornito risultati coerenti tra diversi laboratori, mostrando la loro affidabilità.

Inoltre, l'RNA incapsulato è rimasto stabile per oltre 10 anni a temperatura ambiente. Questa stabilità rende più semplice l'uso in varie situazioni, specialmente dove il controllo della temperatura non è garantito. È anche vantaggioso per preparare grandi stock che possono essere utilizzati nel tempo nei test.

In generale, questo approccio semplifica l'uso di controlli di qualità interni nelle procedure diagnostiche, assicurando che i test rimangano accurati ed efficaci anche in condizioni difficili.