Sviluppi nello studio delle variazioni genetiche con Genome-Shuffle-seq

La variazione genetica umana si riferisce alle differenze nel DNA tra gli individui. Queste variazioni possono influenzare caratteristiche, rischio di malattie e come i nostri corpi reagiscono ai fattori ambientali. I principali tipi di variazione genetica includono varianti di nucleotidi singoli (SNV), inserimenti e delezioni (indel), ripetizioni di sequenze semplici e Variazioni Strutturali (SV). Le variazioni strutturali possono comportare grandi cambiamenti nel genoma, come delezioni, duplicazioni, inversioni e traslocazioni di segmenti cromosomici.

#La Sfida di Studiare le SV

Studiare le SV è stato più difficile rispetto all'analisi delle SNV o degli indel. Questa sfida si presenta sia nella ricerca che coinvolge esseri umani vivi che negli studi di laboratorio che usano organismi modello. Una ragione di questa difficoltà è che le SV de novo sono meno comuni rispetto alle SNV de novo; sono oltre 100 volte più rare per generazione. Questo significa che le SV hanno meno probabilità di apparire ripetutamente nelle generazioni, rendendo difficile collegarle a geni o funzioni specifiche. Al contrario, le SNV o gli indel che colpiscono un singolo gene spesso permettono ai ricercatori di identificare cause chiare delle malattie genetiche.

Inoltre, le SV tendono a interrompere più sequenze di DNA rispetto alle SNV o agli indel, portando a una maggiore possibilità di effetti dannosi sulla fitness. Di conseguenza, nella popolazione umana di solito si trovano meno SV a frequenze comuni, rendendo difficile studiare i loro effetti usando studi su larga scala come gli studi di associazione genome-wide (GWAS). Anche se campioni più grandi possono aiutare in una certa misura, non risolvono completamente le limitazioni legate alle SV.

#Strategie per Studiare le SNV e gli Indel

I ricercatori hanno sviluppato vari metodi per introdurre SNV e indel negli organismi modello per un'analisi dettagliata. Questi metodi includono tecniche di mutagenesi classica e approcci moderni come l'editing di basi. Altre strategie comprendono l'uso di tecniche come la PCR mutagenica per creare una vasta gamma di mutazioni in sequenze di DNA specifiche, che possono poi essere studiate nel loro contesto genetico originale o meno.

Anche se alcune SNV o indel specifiche non appaiono negli esseri umani, analizzarle nei sistemi modello fornisce ancora spunti preziosi. Ad esempio, è possibile identificare quali geni sono coinvolti in caratteristiche o malattie particolari, caratterizzare come diverse varianti genetiche influenzano le sequenze di regolazione o codifica, o prevedere i potenziali impatti delle varianti genetiche associate a malattie. Tuttavia, le SV presentano ancora limitazioni poiché i metodi per generarle e analizzarle nei sistemi modello non sono avanzati come quelli per le SNV e gli indel.

#Domande Senza Risposta sulle SV

A causa delle sfide nello studio delle SV, molte domande sulla loro struttura e funzione nel genoma umano rimangono senza risposta. I geni e gli elementi regolatori sono distribuiti nel genoma in disposizioni specifiche. Comprendere le implicazioni di queste disposizioni è essenziale, ma i ricercatori hanno ancora una comprensione limitata delle loro conseguenze funzionali.

Ad esempio, una parte significativa del genoma umano è formata da deserti genici, ovvero aree con pochi o nessun gene. Anche se alcune sequenze all'interno di queste aree potrebbero avere ruoli, eliminare grandi porzioni di queste regioni sembra non avere effetti visibili su alcuni animali. Altre SV sono note per causare disordini genetici o contribuire al rischio di malattie, ma spesso non è chiaro come lo facciano caso per caso. Inoltre, le variazioni strutturali possono portare a differenze significative nelle dimensioni del genoma, rendendo difficile fare confronti.

#Il Ruolo delle SV Somatiche nel Cancro

Oltre alle SV germinali, le SV somatiche (quelle che si verificano nelle cellule non germinali) sono note per svolgere ruoli critici nello sviluppo del cancro. Alcune forme di SV somatiche, come la cromotrissi e gli EcDNA, sono ora riconosciute come fattori chiave nell'inizio e nella progressione di quasi tutti i tumori umani.

#Ingegnerizzare le SV in Laboratorio

Sono stati sviluppati vari metodi per ingegnerizzare le SV. Ad esempio, siti di riconoscimento specifici possono essere posizionati in luoghi precisi, permettendo ai ricercatori di creare SV specifiche attraverso la Ricombinazione. Questo metodo può essere laborioso e di solito porta a studiare solo poche SV alla volta.

Un altro metodo coinvolge l'uso della tecnologia CRISPR/Cas9 per creare più rotture a doppio filamento contemporaneamente, generando SV in tutto il genoma. Tuttavia, questo approccio presenta sfide come bassa efficienza e potenziale tossicità, rendendo difficile identificare quali cellule contengano SV indotte.

In un impegno significativo, i ricercatori hanno creato un metodo chiamato Genome-Shuffle-seq, che semplifica il processo di generazione e mappatura di migliaia di SV nei genomi dei mammiferi. Una caratteristica chiave di questo metodo è la sua capacità di mappare e identificare facilmente i punti di rottura delle SV con alta precisione all'interno di una popolazione di cellule.

#Come Funziona Genome-Shuffle-seq

Il metodo Genome-Shuffle-seq prevede l'integrazione di sequenze di DNA speciali, note come cassette di shuffle, nei genomi delle cellule mammifere. Ogni cassette di shuffle ha caratteristiche che aiutano a tracciare la loro posizione nel genoma e le SV formate attraverso la ricombinazione tra queste cassette.

Una volta che le cassette sono inserite nel genoma, i ricercatori possono usare un enzima ricombinasi per indurre SV stimolando eventi di ricombinazione tra le cassette di shuffle. Usando un metodo di sequenziamento, possono identificare e quantificare le nuove combinazioni di sequenze di DNA che scaturiscono da questi eventi di ricombinazione.

#Prova di Concetto

Per dimostrare l'efficacia di Genome-Shuffle-seq, i ricercatori hanno introdotto una libreria di cassette di shuffle in una specifica linea di cellule staminali embrionali di topo. Hanno scoperto che la maggior parte delle cassette di shuffle erano distribuite uniformemente attraverso vari cromosomi, permettendo una mappatura e identificazione precisa. Una volta indotte le SV usando la ricombinasi, i ricercatori hanno rilevato migliaia di nuove combinazioni di DNA che indicavano la presenza di SV, mostrando l'efficienza del metodo.

#Vantaggi di Genome-Shuffle-seq

Usando Genome-Shuffle-seq, i ricercatori hanno dimostrato di poter generare e analizzare SV senza dover isolare cloni singoli o eseguire un sequenziamento esteso. Questo metodo consente un modo diretto ed efficiente per mappare le posizioni e i tipi di SV in una popolazione di cellule.

Inoltre, i ricercatori possono catturare le identità delle SV insieme a informazioni sui trascritti cellulari individuali. Questo approccio duale consente loro di studiare come specifiche SV influenzano l'espressione genica e altre funzioni cellulari.

#Osservare la Dinamica Cellulare Dopo l'Induzione delle SV

Dopo aver indotto le SV, i ricercatori hanno monitorato la dinamica di queste cellule nel tempo. Hanno riscontrato una significativa diminuzione nel numero di SV rilevate man mano che il tempo proseguiva, attribuita alla tossicità associata alla ricombinasi. Questa osservazione evidenzia l'importanza di considerare gli effetti degli interventi sulle SV sulla fitness cellulare.

#Genotipizzazione di Singole Cellule

Genome-Shuffle-seq è progettato per essere compatibile con la trascrittomica delle cellule singole. I ricercatori possono separare le cellule in base a marcatori specifici e poi analizzare i loro trascritti e le SV corrispondenti che ospitano. Questo approccio consente ai ricercatori di convalidare e mappare le SV all'interno delle cellule individuali, offrendo spunti sulla relazione tra alterazioni genetiche e comportamento cellulare.

#Rilevamento degli ecDNA

In modo interessante, lo studio ha anche rivelato che l'ecDNA generato durante la formazione delle SV si trovava spesso in quantità maggiori rispetto alla corrispondente delezione genomica. Questa scoperta solleva interrogativi sul comportamento degli ecDNA, incluso se si replicano a tassi diversi rispetto ai cromosomi nativi.

#Limitazioni di Genome-Shuffle-seq

Nonostante il suo potenziale, Genome-Shuffle-seq ha limitazioni. Ad esempio, alcuni tipi di SV potrebbero non essere rilevabili a causa della natura delle cassette di shuffle utilizzate. Miglioramenti sia nel design delle cassette sia nei metodi di sequenziamento potrebbero aumentare il tasso di rilevamento complessivo delle SV.

Un'altra sfida è la rapida deplezione delle SV entro poche settimane dalla loro induzione, complicando lo studio dell'espressione genica e degli effetti cellulari legati a queste varianti. Gli esperimenti futuri potrebbero dover concentrarsi sulla riduzione della tossicità della ricombinazione e sull'ottimizzazione dei sistemi genetici in cui vengono studiate le SV.

#Il Potenziale di Genome-Shuffle-seq

Nonostante queste sfide, Genome-Shuffle-seq apre nuove opportunità per studiare gli impatti delle SV e degli ecDNA sull'espressione genica, sull'organizzazione del genoma e sulla struttura della cromatina. Questo metodo può aiutare i ricercatori a capire come le variazioni genetiche strutturali influenzano vari processi cellulari e identificare potenziali bersagli terapeutici per le malattie associate alle SV.

In conclusione, Genome-Shuffle-seq rappresenta un significativo avanzamento negli strumenti disponibili per studiare la variazione genetica. Permettendo la generazione e la mappatura efficienti delle SV su larga scala, prepara il terreno per svelare i meccanismi sottostanti delle malattie genetiche e il ruolo delle SV nell'evoluzione e nello sviluppo. Questo approccio innovativo ha il potenziale di contribuire sia alla ricerca biologica fondamentale che alle applicazioni pratiche in medicina.