Segnali Wnt e Nodal nello Sviluppo Cellulare

La via di segnalazione WNT è un sistema fondamentale nello sviluppo degli organismi, aiutando a modellare e organizzare i tessuti nelle fasi iniziali della vita. Insieme ad altri sistemi di segnalazione come FGF e TGF-ss, Wnt gioca un ruolo chiave nella formazione della striscia primitiva, che è importante per creare tessuti essenziali come Mesoderma e endoderma. Se questi segnali vengono interrotti, possono verificarsi problemi di sviluppo gravi e anche la morte dell'embrione.

Dopo la fase di gastrulazione, alcune cellule nell'embrione, conosciute come progenitori neuromesodermali (NMP), aiutano a formare il midollo spinale e altre strutture in un ordine specifico. Per mantenere questi NMP, è necessaria una continua segnalazione Wnt e FGF. Se la segnalazione Wnt è interrotta in questo momento, può causare uno sviluppo incompleto dell'embrione, portando a strutture mancanti e altri problemi. Tuttavia, non è ancora del tutto chiaro come Wnt e altri segnali lavorino insieme per determinare il destino di queste cellule.

Studiare la segnalazione cellulare è complesso, specialmente nelle culture standard dove l'arrangiamento e la densità delle cellule possono variare notevolmente e influenzare i risultati. Ricerche precedenti hanno mostrato che forzare le colonie di cellule staminali in forme circolari può portare a schemi cellulari meglio organizzati quando esposti a segnali specifici. Trattando queste colonie circolari con Wnt e FGF, i ricercatori hanno osservato schemi costanti, facilitando lo studio di come le cellule rispondono ai segnali e determinano i loro destini.

Di recente, sono stati sviluppati metodi per produrre alcuni tipi cellulari, come quelli presenti nel mesoderma pre-somito e nella notocorda, in queste colonie micropatterned. Tuttavia, è necessario fare ulteriori ricerche per capire come la dinamica dei segnali influisca su questi destini cellulari e come la segnalazione Wnt interagisca con la formazione di diversi tipi di tessuti.

#Obiettivi dello Studio

Questo studio mira a creare modelli utilizzando micropatterning per comprendere meglio come la segnalazione Wnt influenzi lo sviluppo delle cellule progenitrici posteriori e dei loro derivati. Esperimenti iniziali hanno mostrato che nelle culture standard, il trattamento con Wnt e FGF ha portato a cellule che sembravano NMP. Sorprendentemente, quando gli stessi protocolli sono stati applicati a colonie micropatterned, i risultati erano completamente diversi. Invece di sviluppare NMP, queste colonie formavano strutture tridimensionali complesse con cellule endoderma definitive che circondavano un disco di cellule simili a epiblasto.

Aumentare la quantità di segnalazione Wnt non ha cambiato il destino delle cellule per produrre mesoderma o identità posteriori. I ricercatori hanno scoperto che una proteina chiamata Nodal, parte di un'altra via di segnalazione, era regolata verso l'alto nei micropattern e responsabile di promuovere i destini delle cellule endodermiche. Quando la segnalazione Nodal era attiva, la segnalazione Wnt portava alla formazione di destini della striscia primitiva, mentre inibire la segnalazione Nodal faceva sì che Wnt inducesse destini posteriori in modo dipendente dalla concentrazione.

Inoltre, una molecola chiamata CHIR, comunemente usata per attivare la segnalazione Wnt, ha causato dinamiche di segnalazione diverse e ha permesso la creazione di destini mesodermici posteriori senza dover inibire Nodal.

#Effetti del Micropatterning

La ricerca è iniziata sviluppando un sistema per studiare le dinamiche della segnalazione Wnt che portano allo stato NMP e ad altri destini posteriori, e come questi differiscano da studi precedenti incentrati sulla striscia primitiva e sui destini mesodermici. Gli NMP dipendono da Wnt sia per la loro formazione che per il loro mantenimento. I protocolli stabiliti hanno mostrato che l'uso di attivatori Wnt e FGF poteva indurre lo stato NMP in vitro. Nella cultura standard, alti livelli di co-espressione di specifici marcatori nelle cellule hanno confermato la presenza di NMP.

Quando si eseguiva lo stesso protocollo con cellule su micropattern, è stato trovato che il trattamento con FGF e Wnt risultava in colonie asimmetriche con distinti gruppi di cellule positive per SOX2, circondate da cellule negative per SOX2. La morfologia di queste colonie micropatterned ha causato cambiamenti significativi nelle decisioni sul destino cellulare. Questo ha suggerito che la costrizione fisica non solo influenzava l'organizzazione spaziale, ma cambiava anche il modo in cui le cellule rispondevano al trattamento.

Sorprendentemente, i ricercatori hanno trovato che forme specifiche delle colonie influenzavano costantemente l'arrangiamento delle cellule positive per SOX2, indipendentemente da come era fisicamente modellata la colonia. Si è ipotizzato che i processi dinamici che portano alla differenziazione nelle colonie micropatterned fossero diversi da quelli nelle culture standard.

#Cambiamenti nei Destini Cellulari

Lo studio ha anche cercato di chiarire perché ci fossero meno cellule con caratteristiche NMP nelle colonie micropatterned.

Osservando la progressione delle cellule nel tempo, è stato confermato che una notevole co-espressione di marcatori NMP era presente a tempi iniziali. Tuttavia, entro il giorno tre, molte cellule ai margini della colonia hanno iniziato a perdere questi marcatori, indicando una rapida differenziazione lontano dallo stato NMP.

Tipicamente, quando gli NMP si differenziano in mesoderma pre-somito, regolano verso il basso specifici marcatori mentre regolano verso l'alto altri. Tuttavia, nelle colonie micropatterned, era evidente solo un'espressione sparsa di marcatori mesodermici, suggerendo che le cellule NMP doppio-positive si erano differenziate in diversi destini anziché rimanere come NMP.

I ricercatori hanno esplorato se aumentare i livelli di Wnt avrebbe migliorato o mantenuto i destini cellulari NMP o mesodermici. Sorprendentemente, un aumento dieci volte della concentrazione di Wnt non ha significativamente potenziato l'espressione di marcatori legati a questi destini. In sintesi, gli esperimenti hanno mostrato che semplicemente alzando i livelli di Wnt non si ottenevano efficacemente le identità cellulari mesodermiche o posteriori desiderate.

#Micropattern come Strumento per l'Analisi dei Destini

Per identificare le identità cellulari presenti nelle colonie micropatterned, i ricercatori hanno utilizzato il sequenziamento RNA. Questa analisi ha rivelato che le cellule negative per SOX2 erano impegnate in destini endodermici definitivi, mentre le cellule positive per SOX2 mostrano marcatori relativi all'identità di epiblasto. Interessantemente, le variazioni nella concentrazione di Wnt hanno modificato le proporzioni di cellule che adottavano diverse identità, ma i loro destini complessivi sono rimasti coerenti.

Hanno anche confrontato i loro risultati con un dataset di cellule gastrula umane, confermando che le cellule positive e negative per SOX2 provenienti dai micropattern si allineavano con popolazioni note di endoderma e epiblasto.

I risultati hanno dimostrato che le colonie micropatterned trattate con Wnt e FGF si sviluppavano in una struttura contenente sia cellule di epiblasto che di endoderma definitivo, somigliando molto ai tipi cellulari in vivo trovati durante lo sviluppo iniziale.

#Cambiamenti Morfologici nelle Colonie Trattate

I ricercatori hanno documentato che le colonie trattate hanno subito una significativa morfogenesi, portando a una struttura intricata con strati cellulari distinti. Le cellule endodermiche hanno formato uno strato di base che sosteneva i dischi di epiblasto, creando una forma a "coppa" attorno al disco e formando anche bolle sopra la superficie della cultura.

Questo comportamento ha offerto un'interessante intuizione su come queste cellule potrebbero utilizzare la tensione dell'ambiente per modellarsi, unendosi per formare strutture coese. Osservazioni dei marcatori di giunzione stretta suggerivano che strati cellulari distinti stavano sviluppando una polarizzazione che potrebbe portare a una differenziazione funzionale nelle colonie.

Attraverso l'imaging di cellule vive, i ricercatori sono riusciti a visualizzare come le cellule si muovessero e cambiassero nel tempo. Hanno scoperto che l'espressione di SOX2 era inizialmente diffusa, ma alla fine è diventata ristretta al centro mentre le cellule attorno a essa si differenziavano. Le dinamiche dell'espressione di E-CAD hanno mostrato che la stessa popolazione cellulare era responsabile sia dei marcatore SOX2 che di E-CAD.

Al contrario, le colonie non trattate mantenevano un'espressione più uniforme di questi marcatori e non mostrano le stesse morfologie complesse.

#Dinamiche della Segnalazione Wnt

Per comprendere meglio come funzionasse la segnalazione Wnt all'interno delle colonie, i ricercatori hanno esaminato le dinamiche della trasduzione del segnale Wnt utilizzando una linea cellulare reporter specifica. I risultati hanno indicato che i livelli di segnalazione Wnt in condizioni di controllo rimanevano bassi, mentre le colonie trattate mostrano un rapido incremento nei livelli di ss-catenina nucleare.

Il tempismo dell'attivazione della segnalazione Wnt ha giocato un ruolo cruciale, poiché le cellule ai margini delle colonie hanno iniziato a mostrare alti livelli di segnalazione prima delle cellule interne. Man mano che le cellule si differenziavano in endoderma definitivo, evidenze di segnalazione Wnt attiva si diffondevano verso l'interno, illustrando un meccanismo di feedback che governava il processo di differenziazione.

Confrontando il trattamento a bassa dose di Wnt con dosi elevate, i risultati hanno evidenziato che, sebbene livelli più alti di Wnt portassero a risposte nucleari di ss-catenina più forti, i destini cellulari sottostanti rimanevano simili. È importante notare che la dose di segnalazione Wnt non alterava significativamente i risultati nella differenziazione cellulare, ma era piuttosto influenzata da ulteriori vie di segnalazione.

#Segnalazione Nodal e Destino Cellulare

Lo studio ha evidenziato il ruolo della segnalazione Nodal nel promuovere i destini delle cellule endodermiche definitive. Studi precedenti indicavano che Nodal era essenziale per generare tali destini cellulari in vitro, e la ricerca attuale ha supportato che la segnalazione endogena attraverso Nodal era cruciale.

Quando le colonie sono state trattate con SB431542, un noto inibitore della segnalazione Nodal, i destini delle cellule endodermiche definitive sono stati soppressi, confermando che Nodal stava attivamente guidando queste identità cellulari. Al contrario, l'inibizione della segnalazione BMP non ha influenzato la differenziazione delle cellule endodermiche.

Questo ha portato i ricercatori a esplorare come l'inibizione di Nodal influenzi lo sviluppo dei destini mesodermici. Quando la segnalazione Nodal è stata bloccata, il trattamento ha permesso l'emergere di popolazioni NMP e PSM, dimostrando che queste vie sono intrecciate e sensibili l'una all'altra.

#Tempismo dell'Inibizione di Nodal

Il tempismo della segnalazione Nodal è stato ulteriormente investigato applicando l'inibitore di Nodal a intervalli diversi. Quando l'inibitore è stato applicato dall'inizio del trattamento, è stata osservata un'esplosione significativa nei destini PSM, dimostrando che la segnalazione Nodal precoce fosse vantaggiosa per la formazione di endoderma definitivo.

Al contrario, ritardare l'inibizione fino a stadi successivi ha portato a una popolazione mista di cellule PSM e endoderma definitivo, indicando che alcune cellule erano già impegnate in un destino specifico mentre altre mantenevano flessibilità.

Questi risultati illustrano che il tempismo della segnalazione Nodal è critico per determinare i destini finali delle cellule delle colonie in sviluppo, mostrando come la regolazione fine dei segnali possa influenzare drasticamente i risultati.

#Intuizioni sull'Inibizione di GSK3ss

Infine, i ricercatori hanno esaminato il ruolo dell'inibizione di GSK3ss nei loro esperimenti. La molecola CHIR99021 è stata testata e mostrata per indurre significativamente i destini PSM insieme a una bassa espressione di marcatori di endoderma definitivo. Tuttavia, a differenza del trattamento con Wnt e FGF, l'uso di CHIR non ha portato a una morfogenesi complessa.

Pur inducendo una forte segnalazione Wnt, CHIR ha portato a un'espressione transitoria di Nodal, spiegando perché le cellule si siano orientate verso identità mesodermiche anziché endodermiche. Questo ha sottolineato l'importanza delle dinamiche di segnalazione in gioco, mostrando che, mentre attivare le vie è essenziale, il contesto e il tempismo di quei segnali sono altrettanto cruciali.

#Conclusione

In sintesi, questa ricerca fa luce sull'interazione complessa delle vie di segnalazione Wnt e Nodal nel determinare i destini cellulari durante lo sviluppo. Utilizzando culture micropatterned, lo studio è riuscito a mostrare come le costrizioni fisiche, le dinamiche di segnalazione e il tempismo contribuiscano tutti al processo di differenziazione. I risultati suggeriscono che, mentre Wnt e Nodal sono entrambi necessari per sviluppare specifici tipi di tessuti, il modo in cui interagiscono influisce significativamente su se le cellule diventino endoderma o mesoderma. Queste intuizioni possono informare studi futuri che mirano a modellare i processi di sviluppo in modo più accurato e potrebbero migliorare gli approcci nella medicina rigenerativa e nell'ingegneria tissutale.