Utiliser CRISPRi pour contrôler les infections par des phages

CRISPRi, qui signifie interférence CRISPR, est un super moyen pour étudier comment les gènes fonctionnent chez les bactéries. Cette technique aide les scientifiques à comprendre comment des gènes spécifiques se rapportent à des traits chez les bactéries et comment les virus qui attaquent les bactéries, appelés Bactériophages ou phages, interagissent avec leurs hôtes. On peut aussi s'en servir pour créer de nouvelles manières de contrôler l'activité des gènes chez les bactéries.

Une façon courante d'utiliser CRISPRi implique une version modifiée du système CRISPR d'un type de bactérie appelé Streptococcus pyogenes. Ce système utilise une partie appelée dCas9, qui peut se fixer à l'ADN sans le couper. Quand dCas9 se fixe à l'ADN, ça bloque le processus qui copie l'ADN en ARN, ce qui est une étape nécessaire pour l'expression des gènes.

Pour guider dCas9 au bon endroit sur l'ADN, on utilise un petit morceau d'ARN appelé sgRNA. Cet ARN dirige dCas9 pour se lier à un endroit spécifique sur l'ADN, permettant aux chercheurs d'influencer l'activité de certains gènes. Cette méthode est efficace parce qu'elle peut cibler presque n'importe quel gène chez les bactéries, aidant les scientifiques à enquêter sur les fonctions des gènes avec beaucoup de précision.

#Utiliser CRISPRi pour étudier les phages

Traditionnellement, CRISPRi a surtout été appliqué à l'étude et à la manipulation des gènes au sein des bactéries. Cependant, les scientifiques ont commencé à se demander si ça peut aussi être utilisé pour cibler les phages, notamment pour comprendre les gènes des phages et contrôler leurs cycles de vie. Les phages sont importants parce qu'ils peuvent tuer les bactéries, ce qui les rend précieux pour traiter les infections bactériennes, en particulier celles causées par des bactéries résistantes aux antibiotiques.

Un phage qui a attiré l'attention est le phage T7. T7 est un virus qui infecte les bactéries E. coli, et il fait ça très efficacement. Il a un cycle de vie bien défini que les chercheurs ont étudié pendant des années. T7 a un petit génome, ce qui le rend plus facile à manipuler avec des techniques de laboratoire classiques. En altérant le phage T7, les scientifiques peuvent potentiellement créer de nouvelles thérapies pour les infections bactériennes.

Dans cette étude, les chercheurs se sont concentrés sur l'utilisation de CRISPRi pour influencer le cycle de vie du phage T7. Ils ont sélectionné des parties spécifiques du génome du phage à cibler avec dCas9 et des sgRNAs. Ce ciblage visait à perturber la capacité du phage à infecter et à se répliquer à l'intérieur de l'hôte bactérien.

#Conception de l'expérience

Les chercheurs ont conçu une série de sgRNAs pour cibler des parties essentielles du génome du phage, en particulier celles impliquées dans la capacité du phage à entrer et à prendre le contrôle de la cellule hôte. Ils ont identifié les Promoteurs les plus puissants, ou points de contrôle, dans l'ADN qui aident à initier le processus d'infection et de réplication. En ciblant ces points, ils espéraient ralentir ou même bloquer le processus d'infection du phage.

Pour tester leur approche, les chercheurs ont construit des plasmides, qui sont de petits cercles d'ADN, contenant les sgRNAs. Ils ont aussi créé des systèmes de rapporteurs fluorescents pour mesurer l'efficacité de leur ciblage. L'idée était que si l'approche CRISPRi était efficace, les niveaux de fluorescence devraient diminuer, indiquant que moins de gènes du phage étaient exprimés.

#Observer les effets

Après avoir construit leurs outils, les chercheurs ont introduit les sgRNAs dans des bactéries infectées par le phage T7. Ils ont examiné la rapidité avec laquelle les bactéries se lysaient, ou éclataient, à cause de l'infection par le phage. Le temps qu'il a fallu aux bactéries pour éclater est un indicateur clair de l'efficacité de l'infection par le phage.

Ils ont constaté que le ciblage de certaines parties du génome du phage avec CRISPRi avait un effet notable sur le temps qu'il fallait aux bactéries pour se lyser. En particulier, bloquer un des promoteurs cruciaux a ralenti le processus d'infection, indiquant que cette partie du génome joue un rôle essentiel dans les premières étapes de l'infection.

Fait intéressant, bien que les chercheurs aient découvert que le ciblage du T7 RNAP, qui est crucial pour la réplication du phage, avait un fort effet de diminution en laboratoire, cela n'a pas radicalement changé la rapidité à laquelle les bactéries se lysaient lors de l'infection réelle. Cela suggère que le phage peut avoir des moyens de contourner ce bloc ou de compenser les effets de CRISPRi.

#Résultats supplémentaires

Les chercheurs ont également observé que lorsqu'ils utilisaient plusieurs sgRNAs en même temps, cela augmentait l'efficacité de l'approche CRISPRi. En ciblant plusieurs promoteurs simultanément, ils ont pu obtenir un impact global plus fort sur la capacité du phage à infecter les bactéries.

En termes d'applications pratiques, cette méthode pourrait potentiellement permettre aux scientifiques de concevoir des phages qui peuvent être contrôlés plus précisément. Au lieu de devoir modifier le phage lui-même, ce qui peut être complexe, les scientifiques pourraient utiliser CRISPRi pour influencer le comportement du phage pendant l'infection.

#Conclusion

Cette étude montre que CRISPRi peut être un outil précieux pour étudier comment les phages interagissent avec leurs hôtes bactériens. En ciblant des parties spécifiques du génome du phage, les chercheurs peuvent manipuler le processus d'infection et mieux comprendre la génétique impliquée. Bien qu'il y ait encore des limitations à l'approche, comme des effets de réduction incomplets, les résultats ouvrent de nouvelles possibilités pour utiliser CRISPRi en biologie synthétique et en thérapie par phages.

Dans l'ensemble, les résultats démontrent que les méthodes CRISPRi peuvent influencer les cycles de vie des phages, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies pour lutter contre les infections bactériennes en utilisant des phages et des outils de biologie synthétique. Avec une exploration plus poussée, cette technique pourrait contribuer de manière significative au développement de thérapies innovantes à une époque de résistance croissante aux antibiotiques.