Avancées dans les techniques de microscopie corrélative

La microscopie lumineuse et électronique corrélative (CLEM) est une méthode super pour examiner de près les cellules et leurs parties, en combinant deux types d'imagerie : la microscopie lumineuse et la Microscopie Électronique. Chaque type a ses forces et ses faiblesses. La microscopie lumineuse est géniale pour observer des cellules vivantes et leur comportement, tandis que la microscopie électronique fournit des images très détaillées de la structure cellulaire. En utilisant les deux méthodes ensemble, CLEM permet aux chercheurs d'étudier des événements rares en biologie avec beaucoup de détails et de contexte.

#Comment ça marche la microscopie lumineuse

La microscopie lumineuse utilise la lumière pour éclairer les échantillons, ce qui permet aux scientifiques de voir les structures au niveau cellulaire. Les chercheurs marquent souvent des molécules importantes dans des cellules vivantes avec des protéines colorées spéciales qui brillent quand elles sont touchées par une lumière spécifique. Ce glow leur permet de voir comment ces molécules interagissent pendant que les cellules passent par différentes activités. Cependant, à cause de la façon dont la lumière se comporte, la microscopie lumineuse ne peut résoudre que des détails qui sont à environ 200 nanomètres l'un de l'autre. Ça veut dire que même s'ils peuvent voir de grandes structures, ils ratent souvent les petits détails à l'intérieur des cellules.

#Limites de la microscopie lumineuse

Bien qu'il existe des méthodes pour améliorer la résolution de la microscopie lumineuse, elles nécessitent souvent un équipement spécial et une préparation minutieuse des échantillons, ce qui peut en limiter l'utilisation. De plus, la microscopie lumineuse se concentre généralement sur des molécules spécifiques, négligeant souvent les structures environnantes dans les cellules. Ça peut rendre difficile la compréhension de comment ces molécules s'intègrent dans le tableau plus large de l'organisation cellulaire.

#Avantages de la microscopie électronique

La microscopie électronique surmonte beaucoup de limites de la microscopie lumineuse. Elle atteint une résolution bien plus élevée, permettant aux chercheurs de voir des détails intriqués de la structure cellulaire. Cependant, la microscopie électronique a généralement un champ de vision plus petit, ce qui veut dire que même si elle montre beaucoup de détails dans une petite zone, elle peut ne pas capturer un contexte plus large aussi efficacement.

#Ce que CLEM offre

CLEM combine la microscopie lumineuse et électronique, tirant parti des forces des deux méthodes tout en contournant leurs faiblesses. Cette approche a conduit à des découvertes importantes en biologie, comme la structure des tunnels dans les neurones, la fusion des vaisseaux sanguins chez les poissons-zèbres, et la localisation des bactéries de la tuberculose dans les cellules humaines.

#Étapes dans CLEM

Une façon courante de réaliser CLEM implique deux étapes principales : d'abord, prendre des images avec la microscopie lumineuse, puis avec la microscopie électronique.

1. Préparation de l'échantillon : Cela implique de marquer les structures d'intérêt avec des colorants ou des protéines fluorescentes, permettant aux chercheurs de créer une pile d'images à travers l'échantillon.
2. Imagerie avec la microscopie lumineuse : Les chercheurs acquièrent une série d'images, donnant un aperçu de comment les structures marquées se comportent en temps réel.
3. Préparation pour la microscopie électronique : L'échantillon est traité pour préserver sa structure, teinté avec des métaux lourds pour créer un contraste, puis enveloppé dans une résine.
4. Imagerie avec la microscopie électronique : Des tranches fines de l'échantillon sont coupées pour capturer des images détaillées, résultant en une série d'images qui fournissent une vue à haute résolution des structures.

Après l'imagerie, il existe deux ensembles de piles d'images : un de la microscopie lumineuse et un de la microscopie électronique. Le défi maintenant est d'aligner ces deux ensembles d'images pour que les données des deux méthodes s'accordent, permettant une analyse correcte.

#Alignement des images

Aligner les deux ensembles d'images peut être délicat à cause des différences de résolution, de contraste, et de la manière dont les images ont été prises. Pour donner un sens aux deux ensembles de données, les chercheurs doivent trouver un moyen de les aligner avec précision. Il y a deux méthodes principales pour cela :

1. Traitement des images : Une façon est d'ajuster une ou les deux images pour qu'elles se ressemblent. Une fois qu'elles semblent similaires, des méthodes traditionnelles utilisées en imagerie médicale peuvent être appliquées pour les aligner automatiquement.
2. Utilisation de repères : La deuxième méthode consiste à sélectionner des caractéristiques spécifiques qui peuvent être vues dans les deux techniques d'imagerie. En identifiant et en marquant ces caractéristiques dans les deux ensembles de données, les chercheurs peuvent calculer comment transformer un ensemble d'images pour s'aligner avec l'autre.

#Défis dans l'alignement

Les deux méthodes d'alignement des images ont leurs défis. La première méthode, qui consiste à traiter les images pour les rendre plus semblables, peut être efficace mais nécessite beaucoup de travail préalable. La seconde méthode utilisant des repères est manuelle et peut être fastidieuse, prenant beaucoup de temps, et peut introduire des biais car les caractéristiques choisies pour l'alignement pourraient être similaires à celles étudiées. Donc, trouver des moyens d'automatiser l'identification des repères est très souhaitable.

#Nouveau flux de travail pour CLEM

Pour adresser les problèmes mentionnés, un nouveau flux de travail a été développé pour segmenter les mitochondries, qui sont abondantes et communes dans les cellules. Cette étape aide à trouver des structures correspondantes entre les images de microscopie lumineuse et électronique. Différentes méthodes peuvent être utilisées pour segmenter les images, allant du traitement d'image traditionnel aux techniques avancées d'apprentissage automatique.

Après avoir segmenté les mitochondries, des points sont prélevés de ces Segmentations pour créer un "nuage de points" pour chaque modalité d'imagerie. Les Nuages de points sont une façon de représenter les données qui réduit la quantité d'information à traiter, améliorant ainsi l'efficacité.

#Enregistrement des nuages de points

Une fois que les nuages de points sont créés, ils peuvent être alignés en utilisant des techniques modernes. Une de ces méthodes appelée Coherent Point Drift (CPD) permet de traiter la tâche d'alignement comme un problème de probabilité, ce qui signifie qu'une correspondance stricte un-à-un entre les points n'est pas nécessaire.

Tout le processus fonctionne comme un plugin pour un visualiseur d'images appelé napari. Ce plugin offre une façon simple pour les utilisateurs d'effectuer l'alignement d'un simple bouton ou de faire des ajustements à des étapes spécifiques du flux de travail si besoin.

#Tester la nouvelle méthode

Pour voir à quel point cette nouvelle méthode fonctionne bien, des ensembles de données de référence de cellules HeLa ont été utilisés. Ces ensembles de données permettent des comparaisons contre des alignements manuels d'experts pour évaluer la performance de la nouvelle méthode.

Pour les évaluations, des structures clés non utilisées dans l'enregistrement ont été identifiées, et le chevauchement entre les structures segmentées des deux modalités a été mesuré. Une métrique appelée le taux de vrais positifs (TPR) a été utilisée pour quantifier à quel point les deux images s'alignent bien. Les résultats ont montré que la méthode automatisée a atteint un alignement proche de la performance d'expert.

#Accessibilité et convivialité

Le plugin napari rend cette nouvelle méthode accessible à un plus large éventail d'utilisateurs, y compris ceux qui ne sont pas des experts en microscopie. L'interface permet des opérations rapides, mais elle offre aussi des options pour voir et ajuster les étapes intermédiaires du processus.

Les utilisateurs peuvent facilement ajuster des paramètres et voir comment les changements affectent le résultat, ou même utiliser leurs propres segmentations provenant de différentes sources, ajoutant de la flexibilité au flux de travail.

#Perspectives d'avenir

Bien que le nouveau flux de travail CLEM montre de grandes promesses, il y a encore des défis à surmonter. L'un d'eux est le besoin de meilleures méthodes automatisées pour la segmentation des organites en microscopie électronique. Des méthodes et outils qui facilitent l'entraînement de modèles d'apprentissage profond sont en train d'émerger, permettant aux chercheurs d'améliorer la performance sans avoir besoin de grands ensembles de données dès le départ.

Un autre défi est la taille des ensembles de données d'imagerie biologique. À mesure que ces ensembles de données grandissent, des méthodes pour gérer de plus grandes données sans rencontrer de problèmes de mémoire informatique seront essentielles.

Optimiser le flux de travail pour des temps de traitement plus rapides, notamment en incluant une accélération GPU, est aussi un objectif futur.

#Conclusion

CLEM est une technique puissante qui réunit la microscopie lumineuse et électronique pour obtenir une vue d'ensemble des structures et processus biologiques. Le nouveau flux de travail CLEM automatisé, propulsé par des méthodes avancées de segmentation et de nuages de points, ouvre des possibilités pour des recherches extensives dans de nombreux domaines biologiques. En rendant cette méthode accessible à divers utilisateurs via un logiciel convivial, elle a le potentiel d'améliorer notre compréhension des systèmes biologiques complexes.

Finalement, avec les développements continus dans l'imagerie, les techniques de traitement et l'apprentissage automatique, CLEM continuera d'évoluer, fournissant des aperçus plus profonds sur le fascinant monde des cellules et de leurs composants.