Abordando la resistencia a los antimicrobianos: Perspectivas de E. coli

La salud pública global enfrenta un problema serio con la resistencia a los antimicrobianos. Este problema amenaza la salud humana, lo que hace crucial encontrar maneras de enfrentarlo. Una forma de abordar este tema es mirar cómo las bacterias resisten el tratamiento con antibióticos. Las bacterias tienen diferentes maneras de sobrevivir, que se pueden agrupar en mecanismos reversibles e irreversibles. Entender estos métodos puede ayudar a desarrollar nuevos tratamientos.

#Mecanismos de Resistencia Bacteriana

#Mecanismos Reversibles

Los mecanismos reversibles, también conocidos como mecanismos de tolerancia, no se transmiten genéticamente. Esto incluye cambios en cómo crecen y actúan las bacterias. Por ejemplo, algunas células bacterianas pueden sobrevivir temporalmente a altos niveles de antibióticos sin cambiar su material genético. Esto incluye a los persisters, células viables pero no cultivables, y aquellas en una fase de crecimiento estacionario. Su capacidad para tolerar antibióticos está relacionada con varios factores de estrés, como la escasez de nutrientes o el estrés ambiental. Si las condiciones cambian, pueden volver a ser sensibles a los antibióticos.

#Mecanismos Irreversibles

Por otro lado, los mecanismos irreversibles, generalmente llamados mecanismos de resistencia, son heredables. Esto significa que los cambios en el material genético de las bacterias les ayudan a resistir los antibióticos. Estos cambios pueden ocurrir debido a mutaciones en las proteínas que son el objetivo de los antibióticos, o en proteínas que ayudan a reparar daños, la dormancia o expulsar fármacos. Tales mutaciones llevan a la creación de bacterias resistentes a los antibióticos.

#Aminoglucósidos

Los aminoglucósidos fueron uno de los primeros antibióticos utilizados en humanos. Estos fármacos provienen de azúcares que ocurren naturalmente o están modificados y son efectivos contra muchos tipos de bacterias. Han sido cruciales para tratar diversas infecciones, incluyendo la tuberculosis. Algunos aminoglucósidos comunes son la estreptomicina, la gentamicina y la amikacina. Sin embargo, con el tiempo, el uso de aminoglucósidos disminuyó a medida que nuevos antibióticos llegaron al mercado. Ahora, a medida que crece la resistencia a estos nuevos medicamentos, hay un renovado interés en los aminoglucósidos y en desarrollar nuevos con mejor efectividad.

#Cómo Funcionan los Aminoglucósidos

Los aminoglucósidos interrumpen principalmente la capacidad de las bacterias para producir proteínas. Hacen esto al atacar el ribosoma, específicamente una parte de su estructura llamada subunidad ribosomal 30S. Cuando los aminoglucósidos entran en las células bacterianas, hacen que el ribosoma lea mal el código genético, lo que lleva a proteínas defectuosas. Estas proteínas defectuosas pueden interrumpir la membrana celular bacteriana y permitir que más aminoglucósidos entren, resultando en más daño y eventualmente, en la muerte celular.

#Tolerancia a los Antibióticos

La investigación muestra que ciertas células bacterianas que son tolerantes pueden volverse susceptibles a los aminoglucósidos al usar fuentes de carbono específicas. Cuando estas fuentes de carbono son metabolizadas, puede aumentar la capacidad de las células para absorber estos antibióticos. Esta absorción depende de la energía de los procesos metabólicos de las bacterias.

A pesar de suponer que el uso de energía es necesario para que los aminoglucósidos entren en las bacterias, parece que la desregulación del suministro de energía también podría ser un factor. Alteraciones en cómo se produce la energía pueden afectar las tasas de supervivencia bacteriana cuando se tratan con aminoglucósidos.

#Estudio de Cepas Knockout

En una serie de experimentos, los investigadores probaron varias cepas de E. coli para ver cómo la eliminación de genes vinculados al Metabolismo Energético afectaba la tolerancia a los aminoglucósidos. Se analizaron diferentes cepas con deleciones de genes específicas para determinar cuáles mostraban mayor tolerancia. Los resultados indicaron que la mayoría de las cepas knockout mostraron una mayor tolerancia a los aminoglucósidos en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Sin embargo, algunos mutantes no mostraron el aumento esperado en tolerancia. Esta variabilidad indica que la relación entre el metabolismo energético y la tolerancia a los antibióticos es compleja.

#Perfiles de Tolerancia Dependientes del Tiempo

Los científicos se centraron en cuatro cepas mutantes específicas para una evaluación más detallada. Buscaron cambios en cómo se comportaban las células tolerantes a los antibióticos con el tiempo. Se muestrearon regularmente cultivos celulares para verificar el crecimiento y los niveles de tolerancia. Notablemente, el aumento de la tolerancia en ciertos mutantes no se correlacionó con las tasas de crecimiento celular durante esta fase. En su lugar, estas células demostraron una capacidad temporal para resistir el tratamiento con aminoglucósidos.

Incluso cuando estos mutantes mostraron mayor tolerancia en la fase de crecimiento exponencial media, regresaron a ser sensibles durante la fase de latencia del crecimiento. Esto sugiere que la tolerancia observada podría no ser permanente.

#Absorción Dependiente de Energía

Una hipótesis era que el aumento de la tolerancia en cepas mutantes podría llevar a niveles reducidos de energía, afectando así cómo los aminoglucósidos entraban en estas bacterias. Estudios que involucraron tinciones para la actividad metabólica no revelaron diferencias claras en el perfil energético entre cepas resistentes y sensibles.

Además, medir los niveles de ATP, una moneda energética esencial en las células, no mostró patrones consistentes entre las diferentes cepas. Esto indica que los cambios en el metabolismo energético no están necesariamente vinculados a la tolerancia a los aminoglucósidos.

Los investigadores también utilizaron sensores fluorescentes especializados para monitorear el Potencial de Membrana, un factor crucial para la absorción de medicamentos. Sin embargo, los resultados mostraron que, aunque el fármaco causaba alteraciones en el potencial de membrana, estos cambios eran similares entre las cepas tolerantes y sensibles.

#Desregulación del Potencial de Membrana

Los investigadores intentaron entender cómo los cambios en el potencial de membrana afectaban la tolerancia a los antibióticos. Midieron el impacto de los aminoglucósidos en el potencial de membrana y encontraron cambios significativos. Sin embargo, no se observaron diferencias específicas entre las cepas que mostraban tolerancia y aquellas que no. Incluso el uso de modificaciones genéticas dirigidas a elementos involucrados en la producción de energía no mostró las diferencias esperadas en la susceptibilidad a los aminoglucósidos.

#Análisis Proteómico

Para profundizar, los científicos realizaron un análisis proteómico para identificar cambios en la expresión de proteínas entre cepas con diferentes niveles de tolerancia. Los resultados mostraron un aumento en ciertas proteínas vinculadas al metabolismo energético en cepas con mayor tolerancia. Específicamente, se encontraron proteínas involucradas en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y otras vías metabólicas que fueron reguladas al alza en cepas tolerantes, sugiriendo que estaban compensando por las interrupciones en su metabolismo energético.

Por el contrario, hubo una regulación a la baja consistente de proteínas relacionadas con funciones ribosomales en todas las cepas tolerantes. Esta regulación a la baja podría ayudar a explicar la tolerancia observada a los aminoglucósidos, ya que estas proteínas son esenciales para la síntesis de proteínas, que es lo que interrumpen los aminoglucósidos.

#Conclusión

El estudio indicó que eliminar genes vinculados al ciclo del TCA y la cadena de transporte de electrones lleva a una mayor tolerancia a los aminoglucósidos en E. coli. La investigación demostró que los cambios en el metabolismo energético no se correlacionaron con la absorción de medicamentos dependiente de energía o con el potencial de membrana, sugiriendo que múltiples factores contribuyen a la tolerancia a los antibióticos.

En general, los hallazgos enfatizan la complejidad de cómo el metabolismo energético se relaciona con la tolerancia a los antibióticos. Se necesitarán más estudios para descubrir los mecanismos precisos en juego y desarrollar estrategias efectivas para combatir la Resistencia a los antibióticos en las bacterias.

#Materiales y Métodos

#Cepas Bacterianas y Condiciones de Crecimiento

El estudio utilizó cepas específicas de E. coli, particularmente K-12 MG1655. El proceso de creación de deleciones de genes en estas cepas siguió los protocolos microbiológicos establecidos. Se utilizaron varios químicos, medios y equipos de laboratorio a lo largo del experimento para cultivar y probar las bacterias.

#Ensayos de Crecimiento Celular

Para evaluar qué tan bien crecieron las bacterias bajo diferentes condiciones, se diluyeron cultivos celulares y se monitorearon con el tiempo. La población de células se contó utilizando citometría de flujo, proporcionando un método confiable de cuantificación.

#Ensayos de Supervivencia Clonogénica

Las tasas de supervivencia de las células bacterianas se evaluaron exponiéndolas a antibióticos por un período específico y luego contando el número de células viables que sobrevivieron al tratamiento. Este método proporcionó información sobre la efectividad de los antibióticos contra diferentes cepas.

#Tinción con Sensor Rojo Verde

Este método se utilizó para medir la actividad metabólica y la función de la cadena de transporte de electrones. Las bacterias se tiñieron con un tinte específico que indicaba la función metabólica, proporcionando una confirmación visual de los niveles de actividad.

#Mediciones de ATP

Los niveles intracelulares de ATP se cuantificaron utilizando un kit de ensayo especializado, reflejando el estado energético de las células bacterianas.

#Mediciones de pH

Para determinar el pH interno de las células bacterianas, se utilizó una sonda ratiométrica sensible al pH. Este método permitió a los investigadores evaluar cualquier posible cambio en el pH durante los experimentos.

#Ensayos DiSC3(5)

Se empleó el ensayo DiSC3(5) para monitorear cambios en el potencial de membrana en células bacterianas antes y después de la exposición a antibióticos, ofreciendo una visión de cómo estos tratamientos impactaron la fisiología bacteriana.

#Ensayos de Absorción de Gentamicina

La citometría de flujo también se utilizó para evaluar qué tan bien las bacterias absorbieron los aminoglucósidos. Esto involucró analizar células expuestas a gentamicina etiquetada fluorescente, facilitando la cuantificación de la absorción del fármaco.

#Preparación y Análisis de Muestras Proteómicas

Se extrajeron proteínas de las células bacterianas y se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Este análisis proteómico ayudó a definir varias interacciones proteicas e identificar cambios significativos en los niveles de expresión proteica entre diferentes cepas.

#Análisis Estadístico

Los resultados de los diferentes ensayos se analizaron estadísticamente para determinar la significancia de las diferencias observadas. Esto se realizó utilizando software y métodos estadísticos establecidos, asegurando que se pudieran extraer conclusiones sólidas de los datos.